Name: quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

1. Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной Дизайн Алгоритм <ol><li> Алгоритм, используемый в конструкции Solaris КПЦР зонд / пар праймеров регулирует Tm каждого компонента тем самым позволяя универсальных условий езды на велосипеде. Включение МГБ, или незначительные паз обязательными, группу в зонд увеличивает Tm и позволяет для более коротких зондов быть рассчитаны на большую гибкость и производительность анализа. Как следует из их названия, MGBs представляют собой класс антибиотиков, которые могут вписаться в малом желобе ДНК спирали. MGBs крепятся к 3 или 5 конец ДНК-зонда. В растворе флуоресценции FAM корреспондент зонд гасится Затмение Темный утоления. Когда зонд связывается с целевой последовательности, в результате изменений в 3-D конформация зонд с позволяет сильный флуоресцентный сигнал. Связывание ДНК-зонда к целевой последовательности стабилизируется МГБ, которая позволяет использовать весьма специфичны, короче зондов, сохраняя при соответствующей температуре плавления для ПЦР. Таким образом, обнаружение сигналов происходит во время отжига фазы цель усиления. Во время расширения шаг, МГБ зонд дистанцируется и флуоресценции опять угасает. Потому что зонд непричастности, это не влияет на эффективность ПЦР. </li><li> Еще одна особенность алгоритма Solaris является использование Superbases. Superbases изменяются баз, которые улучшили обязательных способностей для повышения стабильности AT облигаций и устранение Г. Г. самоассоциации в гуанин богатых последовательностей. Более того, они не утолить смежных флуорофоров приводится в 5 конца. Эти базы размещены выборочно, в соответствии с алгоритмом, расширить доступность целевой последовательности. Это дает возможность использовать последовательности, такие как GC богатых регионов, которые иначе были бы избегать в праймеров и зондов. </li><li> Когда это возможно, алгоритм Solaris включает в экзоне узел охватывает регионы в целевой сайт. Это увеличивает специфичность, избегая усиление загрязнения геномной ДНК. </li><li> Важно отметить, что алгоритм также определяет консенсусной последовательности для всех известных вариантов сращивания, так, что все охвачены одной зонд / грунтовка множество. Таким образом, только один анализа необходимы для конкретного гена. </li><li> Наконец, Пробирной Solaris КПЦР дизайн алгоритм использует очень жесткие параметры для критических соображений дизайна в том числе ГК содержания, длина, Tm, и участки однородного нуклеотидов. В результате последовательностей BLAST проанализированы на специфичность, используя 3 различных баз данных: геномные, стенограммы, и псевдогена. </li></ol> 2. Получение Solaris Реагенты <ol><li> Для получения соответствующего Solaris реагентов, посетите <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solaris</a> </li><li> Однажды на сайт нажмите на кнопку &quot;GENEius Поиск товара&quot;. Чтобы перейти непосредственно к GENEius поиска, перейдите на <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Щелкните в окне поиска запрос и выбрать подходящий организм цели. </li><li> Поиск GENEius продукт может обрабатывать множество различных идентификаторов гена. Здесь, введите один из предложенных условий поиска, чтобы найти интересующего гена, в том числе работе Seq присоединении, Гена ID, Гена Symbol, Гена Описание, ID Сэнгер или присоединение номер или номер по каталогу. Затем нажмите на кнопку &quot;Поиск&quot;. </li><li> Определить интерес гена и нажмите на кнопку &quot;Выбор&quot; на левой стороне. Откроется окно, которое показывает различные Thermo Scientific продукты, доступные для гена. В разделе &quot;Продукция&quot; выберите &quot;КПЦР Обнаружение&quot; Tab. </li><li> Под &quot;Солярис экспрессии генов пробирной&quot; заголовок, вы увидите одну оптимальную конструкцию зонда Solaris / грунтовки анализа. Этот анализ будет охватывать все известные варианты сплайсинга вашего гена-мишени. Выбрать требуемое количество. Они доступны в 100, 200, 400 и 1000 X 25 мкл реакции (если анализ будет идентифицирован как сделанные на заказ, 100 размер упаковки будет недоступна). Нажмите на кнопку &quot;Добавить в корзину&quot;. </li><li> Далее, выберите необходимое сочетание мастер для термоциклер, который будет использоваться. Чтобы определить, какой мастер микс будет работать лучше всего с машины доступны, нажмите кнопку &quot;Выясните, какие Master Mix лучше всего работает с вашей Cycler ПЦР!&quot; </li><li> Найти КПЦР циклер, который будет использоваться в меню, чтобы определить, какое сочетание в использовании. </li><li> Вернуться в окно поиска продукта GENEius и выберите необходимое сочетание хозяина. Мастер смесь поставляется в 100, 200, 400 и 1000 размеров реакции. Нажмите кнопку &quot;Добавить в корзину&quot;. </li><li> Предлагаемая ссылка генов и оборотной кДНК комплекты синтеза можно также заказать для полной QRT-PCR анализа. </li><li> Когда Solaris КПЦР реагентов приходят, хранить их при температуре -20 ° С до готовности к использованию. Следующие реагенты должны быть получены: 20X раствор, содержащий два праймера при условии, при 800 нм каждый и один ген конкретных зондом при условии, при 200 нм, sequENCE информации как для зонда и грунтовки, и Solaris КПЦР экспрессии генов Master Mix в 2 раза концентрации. Solaris КПЦР Анализы экспрессии генов стабильны в течение минимум 12 месяцев. Избегать повторного замораживания оттаивания. </li></ol> 3. КПЦР установки <ol><li> Начните КПЦР протокол с кДНК. Всего РНК должны быть извлечены при помощи метода спин колонки. Thermo Scientific Verso кДНК комплект синтеза рекомендуется для обратной транскрипции для получения кДНК. </li><li> Подготовка к КПЦР таянием грунтов, зонды, и мастер-микс на льду. Кроме того, иметь под рукой ПЦР воды класса и непрозрачных белых пластин КПЦР, что может улучшить чувствительность ПЦР в реальном времени. </li><li> Мастер смесь содержит все компоненты для ПЦР в реальном времени в том числе: 1) Термо-Start ДНК-полимеразы, горячего старта версия Thermoprime ДНК-полимеразы. Этот тип полимераза используется для предотвращения неспецифического усиления в ходе реакции, настройке и требует активации шаг при 95 ° С 15 мин. 2) дНТФ в смеси Solaris Master, dTTP заменяет dUTP максимального усиления эффективности 3) Собственные буфера реакции, оптимизированный для работы с Solaris грунт / зонд анализов. Эта реакция буфер содержит синюю краску, чтобы увеличить контраст между реагентом и пластика. 4) ROX, если ваш прибор требует КПЦР ROX. </li><li> После решения имеют талые, перемешать, щелкая трубку (не вихря). Спиновые их вниз, чтобы предотвратить потерю реагента. </li><li> Далее, подготовить 15 мл стерильную пробирку Сокол создать реакционную смесь для интересующего гена, плюс один для ссылки гена, расширение масштабов в зависимости от количества образцов. Подготовка достаточно таких, что три повторяет могут быть подготовлены для каждого образца, в том числе не шаблон управления (NTC) и стандартных образцов кривой, если стандартный метод кривой будет использоваться для анализа. </li><li> Для каждого образца работают на 96-луночный планшет, смешайте следующие: 5 мкл 2X Solaris Mix КПЦР Master, 0,5 мкл Solaris Primer / зонда набор (20X) и ПЦР-класса водой так, что конечный объем реакции, когда-то кДНК добавляется будет 25 мкл. Для каждого образца работают на 384-луночного планшета смеси следующие: 12,5 мкл 2X Solaris Mix КПЦР Мастер, 1,25 мкл Solaris Primer / зонда набор (20X) и ПЦР-класса водой так, что конечный объем реакции, когда-то кДНК Добавлен будет 10 мкл. </li><li> Использование нескольких дозаторов канал, передача мастером микс на соответствующие лунки пластины. Синего красителя, включенные в мастер смесь поможет в отслеживании пипетирования прогресса в белых пластин. Затем добавьте 1-5 мкл кДНК шаблона (для 96-луночного планшета) или 1-2 мкл кДНК шаблона (для 384-луночного планшета). Внесите вверх и вниз, чтобы смешаться. Место пластины в центрифуге и спином вниз, чтобы удалить пузырьки, так как они будут мешать флуоресценции чтениях. </li><li> Программа термоциклер: фермент должен быть активирован с 95 ° С 15 мин (1 цикл). Затем 40 циклов 95 ° C, денатурация в течение 15 секунд, а отжиг и расширения при 60 ° С в течение 60 секунд. </li><li> Место пластины в приборе КПЦР. Запустите программу. </li></ol> Представитель КПЦР результатов с помощью ОС Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Solaris анализы дают надежное обнаружение даже при очень низких концентрациях вход, если судить по эффективности ПЦР и r2 значения. Десять 10-кратного разведения кДНК синтезировали из синтетических ампликона РНК последовательности или последовательности ДНК ампликона усиливался по инструменту ABI 7900HT использованием Solaris КПЦР Анализ экспрессии генов для F2RL1 или CDC20, соответственно. Логарифмической шкале усиления кривые и стандартные кривые приведены вместе с исполнением каждого теста в том числе эффективность, r2 значения, динамический диапазон из 10 log10 разведения, а нижний предел обнаружения. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Solaris анализы дают согласующиеся результаты даже между разными исследователями и лабораториями. siRNAs ориентации ALDOA и PPIB, а также без ориентации управления (NTC), были трансфекции в клетки HeLa при 100, 10, 1 и 0,1 нМ конечные концентрации. Клетки собирают и общей РНК, выделенной 48 часов после лечения. кДНК синтезировали использованием Thermo Scientific Verso Kit Синтез кДНК. Аликвоту кДНК амплифицировали в двух географически разделенных лабораторий, использующих Solaris КПЦР Анализы экспрессии генов для обнаружения ALDOA, PPIB и GAPDH на Рош LightCycler 480 (384-а) платформы. Нокдаун был рассчитан с использованием метода ΔΔCq (нормированная на GAPDH ссылкой гена и NTC-обработанных клеток). Же уровень нокдаун были продемонстрированы как для гена цели между двумя исследователями на обоих сайтах.

Авторы этой статьи являются сотрудники компании Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris КПЦР Анализы обеспечивают простой, улучшенный метод для выполнения КПЦР анализа. Использование высоких алгоритм строгости, включая МГБ технологии и Superbases, эти грунтовки и зонда набора максимальной точности и надежности КПЦР экспериментов. Один грунтовки и зонда набор распознает все известные сращивания вариантов данного гена. Целевой сайт, по возможности, включает в себя экзона охватывающей регионы, чтобы геномной ДНК не усиливается. Эти особенности делают возможным запуск многочисленных проб одновременно, что значительно сокращает время, необходимое для выполнения сложных экспериментов. Так как мастер сочетания синего цвета, можно использовать белые непрозрачные пластины, которые повышают чувствительность КПЦР, не теряя из пипетки. Взятые все вместе, конструктивные особенности Пробирной Solaris КПЦР сделать этот роман анализа КПЦР простой, но высокопроизводительный анализ, который является одновременно конкретным и надежным.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Гена Solaris КПЦР Выражение Пробирной является новым типом грунта / зонд установлен, предназначенных для упрощения процесса КПЦР, сохраняя при этом чувствительность и точность анализа. Эти грунтовки / зонд наборы заранее разработанных до&gt; 98% от человека и мыши геномы и особенности значительные улучшения по сравнению с предыдущим доступных технологий. Эти улучшения стали возможны благодаря алгоритму новый дизайн, разработанный Thermo Scientific эксперты биоинформатики. Несколько удобных функций, которые были включены в Пробирной Solaris КПЦР рационализировать процесс выполнения количественных ПЦР в реальном времени. Во-первых, протокол похоже на обычно используемые альтернативы, так что методы, используемые во время КПЦР, вероятно, будут знакомы. Во-вторых, мастер сочетание синего цвета, что делает настройку КПЦР реакции легче отследить. В-третьих, теплового режима езды на велосипеде одинаково для всех анализов (генов), что позволяет запускать многие образцы в то время и снижает вероятность ошибки. Наконец, зонд и информации грунтовки последовательности при условии, упрощение процесса публикации. Здесь мы показываем, как получить соответствующие реагенты Solaris использованием GENEius функцию поиска продукт найден в заказе веб-сайта (www.thermo.com / Solaris) и как использовать Solaris реагентов для выполнения КПЦР с помощью стандартного метода кривой.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solaris КПЦР Анализы экспрессии генов являются новыми заранее разработанных КПЦР грунт / зонд комбинаций, предназначенных для упрощения процесса КПЦР без ущерба для специфики и надежность анализа.

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop микрообъеме Количественное определение нуклеиновых кислот

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Генотипирование растений и животных образцов без предварительного очистки ДНК

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...