Name: quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

1. Thermo Scientific Solaris qPCR Testi Tasarım Algoritma <ol><li> Solaris qPCR prob / primer çiftleri tasarımında kullanılan algoritma ve böylece evrensel bisiklet koşulları sağlayan her bir bileşenin Tm ayarlar. MGB Ortaklık veya küçük oluk bağlama, prob içinde benzer parçaları Tm artırır ve daha fazla tahlil esneklik ve performans için tasarlanmış gibi kısa probları olanak sağlar. Kendi adından da anlaşılacağı gibi, MGBs DNA sarmalını küçük oluk içine sığabilecek bir sınıf antibiyotiklerin. MGBs bir DNA prob sonuna kadar 3 ya da 5 bağlıdırlar. Çözüm, probun FAM muhabiri floresan Eclipse Dark Quencher ile söndürülür. Prob hedef dizisine bağlanır, prob 3-D yapısındaki değişimin güçlü bir floresan sinyal sağlar. DNA prob hedef sırasına Cilt PCR için uygun erime sıcaklığını korurken, son derece özel, kısa probları kullanımına izin verir MGB tarafından stabilize edilir. Böylece, sinyal algılama hedef amplifikasyon tavlama aşamasında oluşur. MGB prob disassociates uzatma adım sırasında, floresan tekrar söndürülür. Prob kesilir, çünkü PCR verimliliği etkilemez. </li><li> Solaris algoritması bir başka özelliği kullanımı Superbases. Superbases bağlar AT istikrarı geliştirmek ve GG guanin zengin dizileri kendine dernek ortadan kaldırmak için bağlayıcı yetenekleri gelişmiş üsler modifiye edilmiştir. Ayrıca, 5 terminus bağlı bitişik fluorophores söndürmeyecek. Bu bazlar hedef dizilerinin kullanılabilirliğini genişletmek için, seçici algoritmasına göre yerleştirilir. Bu mümkün aksi astar ve sondalar tasarımı önlenmiş olur GC zengin bölgeler olarak dizileri, kullanımı mümkün kılar. </li><li> Mümkün olduğunca, Solaris algoritması, hedef site ekzon kavşağı kapsayan bölgelerde içermektedir. Bu kirletici genomik DNA amplifikasyon kaçınarak özgüllük artar. </li><li> Önemlisi, algoritma, aynı zamanda tek bir prob / astar seti ile kaplı olduğu gibi, bilinen tüm ek varyasyonları için bir konsensüs dizisi, tanımlar. Yani, sadece bir testi ilgi belirli bir gen için ihtiyaç vardır. </li><li> Son olarak, Solaris qPCR Testi tasarım algoritması GC içeriği, uzunluğu, Tm, ve homojen nükleotidlerin uzanan dahil olmak üzere, kritik tasarım konuları için çok sıkı parametreleri kullanır. Genomik, transkript, pseudogene: sonuçlanan dizileri analiz özgüllük için 3 farklı veritabanları kullanılarak BLAST. </li></ol> 2. Solaris Reaktifler Alınması <ol><li> Uygun Solaris reaktifleri elde etmek için, ziyaret <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Bir kez web sitesinde &quot;GENEius Ürün Arama&quot; üzerine tıklayın. GENEius ürün arama doğrudan gitmek için, gitmek <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Sorgulama, arama kutusuna tıklayın ve uygun bir hedef organizma seçin. </li><li> GENEius ürün arama, birçok farklı gen tanımlayıcıları işleyebilir. Burada, Ref Seq Katılım, Gen kimliği, Gen Sembol, Gen Açıklama, Sanger kimliği veya Katılım sayısı, ya da bir katalog numarası da dahil olmak üzere ilgi geni bulmak için önerilen Arama terimlerinizi girin. Daha sonra, &quot;Ara&quot; tıklayın. </li><li> Ilgi gen belirlenmesi ve sol tarafta &quot;Select&quot; tıklayın. Bu ilgi gen farklı Thermo Scientific ürünleri gösteren bir pencere açılacaktır. &quot;Ürünler&quot; başlığı altında &quot;qPCR Algılama&quot; sekmesini seçin. </li><li> Başlığı &quot;Solaris Gen İfadesi Testi&quot; altında, bir optimal Solaris prob / astar tahlil tasarlanmış göreceksiniz. Bu bir testi gen hedef bilinen tüm splice varyantları kapsayacaktır. Istenilen miktar seçin. 100, 200, 400 mevcuttur ve 1000 X 25 ul reaksiyonlar (tahlil için sipariş olarak tespit ise, 100 paket boyutu mümkün olmayacaktır). &quot;Sepete Ekle&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Daha sonra, kullanılacak olan termal cycler için uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı makine ile mevcut olan en iyi çalışacak belirlemek için, tıklayın &quot;Master Mix PCR Cycler ile en iyi çalıştığını öğrenin!&quot; </li><li> Menü kullanımı hangi karışımı belirlemek için kullanılan olacak qPCR cycler bul. </li><li> GENEius ürün arama penceresine geri dönün ve uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı, 100, 200, 400, ve 1000 reaksiyon boyutları gelmektedir. &quot;Sepete Ekle&quot; yi tıklatın. </li><li> Önerilen referans genler ve verso cDNA sentezi kitleri de tam bir QRT-PCR analizi için sipariş edilebilir. </li><li> Solaris qPCR reaktifler geldiğinizde, kullanıma hazır olana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. Aşağıdaki reaktifler alınan olmalıdır: 200 nm, sequ sağlanan her bir gen spesifik prob 800 nM iki primer içeren 20X çözümprob ve primerler ve 2X bir konsantrasyonda Solaris qPCR Gen İfadesi Master Mix için referans bilgileri. Solaris qPCR Gen İfade Tahliller en az 12 ay boyunca stabildir. Tekrarlanan dondurulmasından kaçının. </li></ol> 3. qPCR kurulum <ol><li> QPCR protokolü cDNA ile başlayın. Toplam RNA bir spin kolon yöntemi ile elde edilmelidir. Thermo Scientific Verso cDNA sentezi kiti cDNA oluşturmak için ters transkripsiyon için tavsiye edilir. </li><li> Astar, sondalar, çözülme ve buz üzerinde ana karışımı qPCR için hazırlayın. Ayrıca yanda PCR sınıf su ve real-time PCR hassasiyeti artırabilir, opak beyaz qPCR tabak, var. </li><li> 1) Thermo-Başlangıç ​​DNA polimeraz, Thermoprime DNA polimeraz sıcak bir başlangıç ​​sürümü: master karışımı da dahil olmak üzere, gerçek zamanlı PCR tüm bileşenleri içerir. Bu tür polimeraz reaksiyon ayarlamak sırasında non-spesifik amplifikasyon önlemek için kullanılan ve Etkinleştirme adımını 95 ° C&#39;de 15 dakika gerektirir. 2) Solaris Master karışımı dNTP dTTP Solaris astar / sonda deneyleri ile çalışmak üzere optimize Tescilli reaksiyon tamponu amplifikasyon verimliliğini 3), en üst düzeye çıkarmak için dUTP yerini almıştır. Bu reaksiyon tamponu, reaktif ve plastik arasındaki kontrastı arttırmak için mavi boya içerir. 4) ROX qPCR araç gerektiriyorsa ROX. </li><li> Çözümleri çözülmüş sonra, tüp (vorteks) hafifçe vurarak karıştırın. Reaktif kaybını önlemek için onları aşağı spin. </li><li> Sonra, numune sayısına göre ölçekleme ilgi gen, artı için bir referans gen, reaksiyon karışımı kurmak için 15 ml steril Falcon tüp hazırlar. Üç analiz için standart eğri yöntemi kullanılacaksa, bir şablon kontrolü (NTC) ve standart eğri örnekleri de dahil olmak üzere, her bir örnek için hazırlanmış olabilir çoğaltır öyle ki yeterli hazırlayın. </li><li> 96 plaka üzerinde çalışan her bir örnek için, aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 5 mcL, 0,5 Solaris Primer / Prob seti (20X) ul, ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 25 mcL olacak eklenir. 384 plaka üzerinde çalışan her bir numune için aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 12.5 mcL, Solaris Primer / Prob seti (20x) 1.25 ul ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 10 mcL eklenir olacaktır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plaka uygun kuyular için ana karışımı aktarın. Master miks içerisinde yer alan mavi boya beyaz tabak izleme pipetleme ilerleme yardımcı olacaktır. Ardından, 1-5 mcL cDNA şablon (96 plaka için) veya cDNA şablonu 1-2 mcL (384 plaka) ekleyin. Karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Santrifüj plaka koyun ve bu floresan okumaları ile engel olacak şekilde, herhangi bir kabarcıkları aşağı doğru döndürün. </li><li> Program termal cycler: enzimi ile aktive edilmelidir 95 ° C 15 dakika (1 döngü). Sonra 40 döngü 95 ° C, 15 saniye denatürasyon, tavlama ve uzatma, 60 ° C 60 saniye boyunca. </li><li> QPCR araç plaka yerleştirin. Programı başlatın. </li></ol> Solaris kullanarak Temsilcisi qPCR sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. PCR verimliliği ve r2 değerleri tarafından değerlendirilecek Solaris testleri, çok düşük girdi konsantrasyonlarda bile güvenilir şekilde algılanmasını sağlar . Sentetik RNA Amplikon dizisi veya DNA Amplikon dizisi sentezlenen cDNA On 10 kat dilüsyonlarının sırasıyla F2RL1 veya CDC20, Solaris qPCR Gen İfade Testi kullanarak bir ABI 7900HT enstrüman güçlendirildi. Log-ölçek büyütme eğrileri ve standart eğrileri, verimliliği, r2 değeri, 10 log10 dilüsyonları dinamik aralık ve algılama alt sınırı da dahil olmak üzere her bir testin performansı ile birlikte gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Solaris Tahliller hatta farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında tutarlı sonuçlar verir. ALDOA ve PPIB yanı sıra hedefleme Kontrolü (NTC) hedefleyen siRNA&#39;lar, 100, 10, 1 ve 0.1 nM son konsantrasyonları HeLa hücrelerine transfekte edildi. Hücreler hasat ve 48 saat tedavi sonrası total RNA izole edildi. Thermo Scientific Verso cDNA Sentezi Kit kullanılarak cDNA sentezlendi. Roche LightCycler 480 (384-iyi) platformu üzerinde Solaris qPCR Gen İfade Tahliller ALDOA, PPIB ve GAPDH tespiti için coğrafi olarak ayrılmış iki laboratuvarlarda cDNA bir kısım güçlendirildi. Demonte ΔΔCq (GAPDH referans gen ve NTC-tedavili hücrelerde normalize) yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Demonte ile aynı düzeyde, hem de araştırmacılar her iki site arasındaki gen hedefleri hem için gösterildi.

Bu makalenin yazarları, Thermo Scientific çalışanları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Tahliller qPCR analiz yapmak için basit, gelişmiş bir yöntem sağlar. MGB teknolojisi ve Superbases içeren, yüksek darlığı algoritması kullanarak, bu astar ve prob setleri qPCR deneylerin doğruluk ve sağlamlık en üst düzeye çıkarmak. Bir astar ve prob seti, belirli bir gen bilinen tüm ek varyantları tanır. Hedef site, mümkün olduğunca bu genomik DNA amplifiye değildir sağlamak için ekzon kapsayan bölgeler, içerir. Bu özellikler mümkün karmaşık deneyler gerçekleştirmek için gereken zaman miktarını büyük ölçüde azaltarak, aynı anda çok sayıda örnekleri çalıştırmak için. Ana karışımı mavi olduğundan, beyaz opak pipetleme takip kaybetmeden, qPCR duyarlılığını artırmak tabak, kullanmak mümkündür. Hep birlikte ele alındığında, Solaris qPCR Testi tasarım özellikleri bu romanı qPCR tahlil, hem özel ve hem de sağlam bir yüksek performanslı, henüz basit bir tahlil yapmak.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Solaris qPCR Gen İfade Testi, testin duyarlılığı ve hassasiyeti korurken qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış primer / prob seti bir roman türüdür. Bu primer / prob setleri&gt;% 98, daha önce mevcut teknolojilerin insan ve fare genomlarından ve özellik önemli iyileştirmeler için önceden tasarlanmış. Bu gelişmeler Thermo Scientific biyoinformatik uzmanları tarafından geliştirilen yeni tasarım algoritması sayesinde mümkün olmuştur. Birçok kullanışlı özellikleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR performans sürecini kolaylaştırmak için Solaris qPCR Testi içine dahil edilmiştir. İlk olarak, protokol sık istihdam alternatifleri benzer, bu yüzden qPCR sırasında kullanılan yöntemleri aşina olmak için muhtemeldir. İkinci olarak, ana karışımı, mavi izlemek için qPCR reaksiyonlar daha kolay ayar yapar. Üçüncü olarak, termal döngü koşulları mümkün bir anda birçok örnekleri çalıştırmak ve hata potansiyelini azaltarak, (genler), tüm testleri için aynıdır. Son olarak, prob ve primer sırası bilgilerinin, yayın sürecinin basitleştirilmesi sağlanır. Burada, sipariş web sitesi (www.thermo.com / solaris) ve standart eğri yöntemi kullanılarak qPCR gerçekleştirmek için Solaris reaktifleri kullanmak bulundu GENEius ürün arama özelliğini kullanarak uygun Solaris reaktifleri elde etmek için nasıl gösterilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solaris qPCR Gen İfadesi Tahlilleri testinin özgüllük ve sağlamlık ödün vermeden qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış yeni önceden tasarlanmış qPCR primer / prob kombinasyonları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...