Name: a protocol for the production of klrg1 tetramer
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer at JoVE.com

Vi tackar Dr Naidenko om hjälp med att optimera vika förhållanden. Detta arbete stöddes av NIH forskningsanslag AI58181 till Laurent Brossay. Cindy Banh stöds av NIH NRSA F31 AI080230. Stephanie Terrizzi och Cindy Banh bidra lika mycket till detta arbete.

Beredning av inklusionskroppar <ol><li> Inokulera 4 x 500 ml kolvar av TB var och en innehåller 50 mikrogram / ml Carbenicillin och kloramfenikol med en övernattning kultur av bakterier uttrycka KLRG1 plasmiden konstruera. När OD når 0,6 A vid 600 nm, framkalla med tillägg av 0,4 M IPTG och inkubera kulturen i ytterligare 4 timmar skaka vid 37 ° C. </li><li> Resuspendera skördas cellerna i resuspension pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (w / v) sackaros, 1 mM EDTA, 10 mm DTT). Obs: pellets kan frysas i detta skede. ...

<ol>
	<li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1.">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li><li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1.">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li><li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity.">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li><li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition.">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li><li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+(KLRG1).">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , .</li></ol>

I detta protokoll, visas det hur man kan rena, biotinylate och tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer kan användas för att märka KLRG1 ligander med flödescytometri. Trots att vika villkor kommer att testas empiriskt för varje protein kan andra C-typ lektiner vara tetramerized med ett liknande protokoll. Använda tetramerized proteiner som prober, ligander till föräldralösa C-typ lektin receptorer skulle kunna identifieras.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BirA Enzyme and Buffer</td>
<td>Biotinylation Kit</td>
<td>Avidity</td>
<td>BIRA500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Stirred Cell</td>
<td>Equipment</td>
<td>Millipore</td>
<td>Model #8400</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane</td>
<td>Filtration Supply</td>
<td>Millipore</td>
<td>13642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml YM10 concentrator</td>
<td>Filtration Supply</td>
<td>Millipore</td>
<td>4411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AKTAFPLC</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1900-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1166-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strepavidin PE</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>554061</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a protocol for the production of klrg1 tetramer

Killer cell lektin-like receptor G1 (KLRG1) är en typ II transmembrant glykoprotein hämmande receptor som tillhör C-typ lektin-liknande superfamiljen. KLRG1 finns både som monomer och som disulfide-linked homodimer. Denna väl bevarade receptorn finns på de mest mogna och nyligen aktiverade NK-celler samt på en delmängd av effektor / minne T-celler. Använda KLRG1 tetramer såväl som andra metoder, E-, N-och R-cadherins identifierades som KLRG1 ligander. Dessa Ca2 +-beroende cell-cell adhesionsmolekyler består av en extracellulär domän som innehåller fem cadherin upprepar ansvarig för cell-cell interaktioner, en transmembranös domän och ett cytoplasma domän som är kopplad till aktin cytoskelettet. Generationen av KLRG1 tetramer var viktigt att identifieringen av KLRG1 ligander. KLRG1 tetramer är också ett unikt verktyg för att belysa de roller cadherin och KLRG1 spela i regleringen av immunförsvaret och vävnaden integritet.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer at JoVE.com

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Detta protokoll beskriver produktionen av KLRG1 tetramer, som är ett kraftfullt verktyg för analys av KLRG1 ligander.

Ett protokoll för produktion av KLRG1 tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Protokoll för Mosquito Uppfödning (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Visualisering antigenspecifikt CD4 + T celler med MHC klass II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Produktionen av C. elegans Transgener via Recombineering med GalK Markör

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

En bekväm och General uttryck plattform för produktion av utsöndrade proteiner från humana celler

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Ett enkelt protokoll för att extrahera hemocyter från Wild Larver

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM protokollet om ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Mätning och analys av extracellulärt Acid Production att bestämma glykolytisk Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Novel Produktions Protokoll för Småskalig Tillverkning av probiotiska fermenterade livsmedel

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

En Multi-hål cryovial Eliminerar Frysning Artefakter när Muscle Vävnader Direkt Nedsänkt i flytande kväve

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Ett protokoll för laboratoriet bostäder av turkos Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...