Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Ons werk op lokalisatie RNA wordt ondersteund door een subsidie ​​van de NIH (R01GM071049) naar KLM.

Deel 1: Transcriptie van fluorescent gelabelde mRNA. <ol><li> Lineariseren plasmide DNA dat het RNA lokalisatie element of andere relevante reeks en resuspendeer bij 1 ug / ul met DEPC behandeld H 2 O. De DNA-template moet stroomopwaarts promoter sites voor transcriptie door T7, SP6 of T3 RNA polymerase. </li><li> Voeg de volgende reagentia om een ​​steriele 1,5 ml tube: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx buffer (zie M &amp; M) </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> b. 20X cap / NTP mix (zie M &amp; M) </td><t...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Hier hebben we voorgesteld een protocol voor het visualiseren van mRNA lokalisatie in Xenopus oöcyten. Deze methode, met behulp van fluorescent gelabelde RNA-transcripten heeft een hogere signaal-ruisverhouding dan voorheen verkregen met digoxigenine-gelabeld transcripties en is eenvoudiger en sneller dan in-situ gebaseerde benaderingen (Mowry en Melton, 1992, Gautreau et al.., 1997). Met deze methode kunnen we engineer RNA-sequentie mutaties en snel te testen voor in vivo-functie. Verder, door gebrui...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Tx buffer <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM spermidine-HCl </li></ul> 20x cap / NTP mix <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap Analoog (New England Biolabs) </li></ul> G-50 kolom <ul><li class="none"> Hydrate 5 g Sephadex G-50 kralen (Sigma Aldrich) in 100 ml gedeïoniseerd H 2 O. DEPC-treat gedurende 30 minuten. en autoclaaf. Bewaar incomplete voorraad bij kamertemperatuur. Voor gebruik, voeg dan de volgende RNase-vrij-oplossingen: </li><li class="none"> 0,5 ml 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml 20% SDS </li><li class="none"> Slaat complete G-50 oplossing bij 4 ° C. </li><li class="none"> Te verwijderen en de zuiger gooi van een 3 ml spuit (BD Biosciences) en plaats de loop van de spuit in een 15 ml conische buis (Corning). Sluit de spuit met een kleine hoeveelheid van glaswol (een plug ongeveer de helft van de grootte van een cent). </li><li class="none"> Swirl volledige G-50 oplossing voor de kralen mengen. </li><li class="none"> Voeg 2 ml G-50 oplossing voor de lege kolom. </li><li class="none"> Spin gedurende 1 minuut bij 1000 x g in benchtop centrifuge. </li><li class="none"> Voeg 200 ul DEPC behandeld gedeïoniseerd H 2 O aan elke kolom. Spin. </li><li class="none"> Herhaal dit nog twee keer te wassen voor een totaal van drie wasbeurten. </li><li class="none"> Verwijder de spuit vat om een ​​frisse 15 ml conische buis. </li></ul> Collagenase oplossing <ul><li class="none"> 75 mg collagenase van Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH buffer <ul><li class="none"> 88 mM NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 X 7H 2 O </li><li class="none"> 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Eicel Cultuur Medium <ul><li class="none"> 50% L15 medium </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml insuline </li><li class="none"> 100 mg / ml gentamicine </li><li class="none"> 50 U / ml nystatine </li><li class="none"> 50 U / ml penicilline </li><li class="none"> 50 mg / ml streptomycine </li></ul> MEMFA oplossing <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% formaldehyde </li></ul> Computing RNA opbrengst <ul><li class="none"> Bepaal CPM in &quot;input&quot; en &quot;opgenomen&quot; monsters met behulp van een standaard scintillatieteller. </li><li class="none"> incorporatie = (&quot;opgenomen&quot;) / (10 x &quot;input&quot;) </li><li class="none"> Typische oprichting waarden variëren tussen ~ 0,03 en 0,10. </li><li class="none"> Maximale theoretische rendementen voor verschillende polymerasen: T7, T3, SP6 - 2,64 microgram </li><li class="none"> Reactie opbrengst in ug = (maximale opbrengst van de polymerase gebruikt) X (oprichting) </li><li class="none"> Verdunnen RNA tot 50 nM = (ug RNA) / 320 / (lengte van de RNA in bases) / (5x10 -8) </li><li class="none"> De reactie levert meestal ~ 50 tot 100 ul van RNA op 50 nM. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

RNA lokalisatie is een geconserveerd mechanisme van oprichting van celpolariteit. VG1 mRNA lokaliseert aan de plantaardige pool van Xenopus laevis oöcyten en handelt om ruimtelijk te beperken genexpressie van VG1 eiwit. Strikte controle van de VG1 distributie op deze manier is vereist voor een goede kiemlaag specificatie in de zich ontwikkelende embryo. RNA sequentie elementen in de 3 &#39;UTR van het mRNA, de VG1 lokalisatie element (VLE) zijn vereist en voldoende zijn om rechtstreeks vervoer. De studie van de erkenning en het transport van VG1 mRNA in vivo, hebben we een beeldvormende techniek die een uitgebreide analyse van de trans-factor gericht transport mechanismen kan via een eenvoudige visuele uitlezing. Te visualiseren RNA lokalisatie, we synthetiseren fluorescent gelabelde VLE RNA en microinject dit transcript in individuele eicellen. Na een eicel cultuur om het vervoer van de geïnjecteerde RNA toe te staan, eicellen staan ​​vast en uitgedroogd voorafgaand aan de beeldvorming door confocale microscopie. Visualisatie van mRNA lokalisatie patronen biedt een uitlezing voor het toezicht op de volledige route van RNA transport en voor het identificeren van rollen in regie RNA vervoer voor cis-werkende elementen binnen de transcriptie en trans-werkende factoren die binden aan de ELO (Lewis et al.., 2008, Messitt et al.., 2008). We hebben uitgebreid deze techniek door middel van co-localisatie met extra RNA en eiwitten (Gagnon en Mowry, 2009, Messitt et al.., 2008), en in combinatie met verstoring van motorische eiwitten en het cytoskelet (Messitt et al., 2008). Te probe mechanismen ten grondslag liggen mRNA lokalisatie.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualisatie van<em&gt; In vivo</em&gt; RNA transport wordt gerealiseerd door micro-injectie van fluorescent gelabelde RNA transcripten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen, gevolgd door confocale microscopie.

Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...