Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Notre travail sur la localisation d&#39;ARN est soutenu par une subvention du NIH (R01GM071049) à KLM.

Partie 1: La transcription de l&#39;ARNm marqué par fluorescence. <ol><li> Linéariser l&#39;ADN plasmidique contenant l&#39;élément de localisation ou d&#39;autres séquences d&#39;ARN pertinentes et remettre à 1 ug / ul avec DEPC traitées H 2 O. La matrice d&#39;ADN doit avoir des sites promoteur en amont de la transcription par T7, SP6 ou T3 ARN polymérase. </li><li> Ajouter les réactifs suivants dans un tube stérile de 1,5 ml: <table><tbody><tr><td> a. Tx 10X tampon (voir M &amp; M) </td><td> 2 ...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Ici, nous avons présenté un protocole pour la visualisation de la localisation d&#39;ARNm dans les ovocytes de Xénope. Cette méthode, en utilisant des ARN transcrits marqués par fluorescence a plus de signal sur bruit que précédemment obtenus avec marquées à la digoxigénine transcriptions et est plus simple et plus rapide que in situ des approches fondées (Mowry et Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). En utilisant cette méthode, nous pouvons concevoir l&#39;ARN mutations séquence et tester rapidem...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X tampon Tx <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM spermidine-HCl </li></ul> 20x CAP / NTP mélangez <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM d&#39;ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (PPP) G Cap analogique (New England Biolabs) </li></ul> Colonne G-50 <ul><li class="none"> Hydratez 5 g de Sephadex G-50 perles (Sigma Aldrich) dans 100 ml d&#39;eau désionisée H 2 O. DEPC traiter pendant 30 min. et autoclave. Magasin de stock incomplète à la température ambiante. Avant utilisation, ajoutez la ligne suivante sans RNase solutions: </li><li class="none"> 0,5 ml d&#39;EDTA 0,2 M </li><li class="none"> 1 ml Tris 1 M pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml SDS à 20% </li><li class="none"> Boutique complète G-50 une solution à 4 ° C. </li><li class="none"> Retirez et jetez le piston d&#39;une seringue de 3 ml (BD Biosciences) et placer le canon de la seringue dans un tube de 15 ml conique (Corning). Branchez la seringue avec une petite quantité de laine de verre (une prise près de la moitié de la taille d&#39;un penny). </li><li class="none"> Swirl complète G-50 une solution pour remettre perles. </li><li class="none"> Ajouter 2 ml solution G-50 à la colonne vide. </li><li class="none"> Spin pendant 1 minute à 1000 x g dans la centrifugeuse de paillasse. </li><li class="none"> Ajouter 200 ul traitée par DEPC désionisée H 2 O pour chaque colonne. Spin. </li><li class="none"> Répétez laver deux fois plus pour un total de trois lavages. </li><li class="none"> Enlevez seringue à un frais 15 ml tube conique. </li></ul> Solution de collagénase <ul><li class="none"> 75 mg de la collagénase de Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH tampon <ul><li class="none"> 88 mM de NaCl </li><li class="none"> 1 mM de KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X </li><li class="none"> 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM de CaCl 2 X 6 H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Milieu de culture des ovocytes <ul><li class="none"> 50% du milieu L15 </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml d&#39;insuline </li><li class="none"> 100 mg / ml de gentamicine </li><li class="none"> 50 U / ml de nystatine </li><li class="none"> 50 U / ml de pénicilline </li><li class="none"> 50 mg / ml de streptomycine </li></ul> MEMFA solution <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> EGTA 2 mM </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> Formaldéhyde 3,7% </li></ul> Informatique ARN rendement <ul><li class="none"> Déterminer CPM dans &quot;entrée&quot; et &quot;incorporé&quot; des échantillons en utilisant un compteur à scintillation standard. </li><li class="none"> l&#39;incorporation = («incorporée») / (10 x &#39;&quot;entrée&quot;) </li><li class="none"> Les valeurs habituelles se situent entre l&#39;incorporation ~ 0,03 et 0,10. </li><li class="none"> Rendements maximums théoriques pour polymérases différentes: T7, T3, SP6 - 2,64 g </li><li class="none"> Rendement de la réaction en pg = (rendement maximal de la polymérase utilisée) X (constitution) </li><li class="none"> Diluer l&#39;ARN à 50 nM = (g ARN) / 320 / (longueur de l&#39;ARN dans des bases) / (5X10 -8) </li><li class="none"> La réaction généralement des rendements de 50 à 100 ~ ul d&#39;ARN à 50 nM. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

La localisation d&#39;ARN est un mécanisme conservé d&#39;établir la polarité cellulaire. Vg1 ARNm se localise dans le pôle végétal des ovocytes de Xenopus laevis et agit pour restreindre l&#39;espace d&#39;expression génique des protéines Vg1. Un contrôle strict de la distribution Vg1 de cette manière est requise pour la spécification de la couche germe de bon dans l&#39;embryon en développement. Des éléments de séquence d&#39;ARN en 3 &#39;UTR de l&#39;ARNm, l&#39;élément Vg1 localisation (VLE) sont nécessaires et suffisantes pour le transport direct. Pour étudier la reconnaissance et de transport de Vg1 ARNm in vivo, nous avons développé une technique d&#39;imagerie qui permet une analyse approfondie des facteurs de trans-mécanismes de transport dirigé via une lecture visuelle simple. Pour visualiser la localisation d&#39;ARN, nous synthétisons marqué par fluorescence ARN VLE et microinject cette transcription dans des ovocytes individuels. Après la culture des ovocytes pour permettre le transport de l&#39;ARN injecté, les ovocytes sont fixes et déshydratés avant d&#39;imagerie par microscopie confocale. Visualisation des schémas de localisation d&#39;ARNm fournit une lecture de surveillance de la voie complète de l&#39;ARN de transport et d&#39;identification des rôles dans la direction de l&#39;ARN de transport pour les éléments agissant en cis au sein de la transcription et facteurs agissant en trans qui se lient à l&#39;VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nous avons étendu cette technique à travers la co-localisation avec des ARN et des protéines supplémentaires (Gagnon et Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), et en combinaison avec perturbation des protéines motrices et le cytosquelette (Messitt et al., 2008) à la sonde mécanismes sous-jacents de localisation d&#39;ARNm.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualisation des<em&gt; In vivo</em&gt; ARN de transport se fait par micro-injection d&#39;ARN transcrits marqués par fluorescence dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocytes, suivi par microscopie confocale.

Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Recherche

Biologie

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d&#39;hôte

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Mesure de transport de cations Na, K et H, K-ATPase dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Les ovocytes par spectrophotométrie d&#39;absorption atomique: une alternative à dosages radio-isotopes

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...