Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
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Unsere Arbeiten zur RNA-Lokalisierung wird durch einen Zuschuss von der NIH (R01GM071049) auf KLM unterstützt.

Teil 1: Transkription von fluoreszenzmarkierten mRNA. <ol><li> Linearisieren Plasmid-DNA mit dem RNA-Lokalisierung Element oder anderen relevanten Sequenz-und resuspendieren bei 1 ug / ul mit DEPC-behandeltem H 2 O. Die DNA-Vorlage muss stromaufwärts liegende Promotor Standorte für die Transkription durch T7, SP6 oder T3-RNA-Polymerase. </li><li> Fügen Sie die folgenden Reagenzien in ein steriles 1,5 ml Tube: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx-Puffer (siehe M &amp; M) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> b. 2...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Hier haben wir ein Protokoll für die Visualisierung von mRNA-Lokalisierung in Xenopus Oozyten vorgestellt. Diese Methode, mit fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte hat höheres Signal-Rausch-Verhältnis als bisher mit Digoxigenin-markierten Transkripte erhalten und ist einfacher und schneller als in-situ Ansätze (Mowry und Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Mit dieser Methode können wir Ingenieur-RNA-Sequenz Mutationen und schnell für die in vivo Funktion zu testen. Ferner kann durch die Verwend...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Tx Puffer <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM Spermidin-HCl </li></ul> 20x Kappe / NTP-Mix <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap Analog (New England Biolabs) </li></ul> G-50-Säule <ul><li class="none"> Hydrate 5 g Sephadex G-50-Perlen (Sigma Aldrich) in 100 ml deionisiertem H 2 O. Für 30 min DEPC-Behandlung. und Autoklaven. Shop unvollständige Lager bei Raumtemperatur. Vor dem Einsatz, fügen Sie die folgenden RNase-freie Lösungen: </li><li class="none"> 0,5 ml 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml 20% SDS </li><li class="none"> Speichern Sie alle G-50-Lösung bei 4 ° C. </li><li class="none"> Entfernen und entsorgen Sie den Kolben aus einer 3 ml-Spritze (BD Biosciences) und platzieren Sie den Zylinder der Spritze in eine 15 ml konischen Rohr (Corning). Stecken Sie die Spritze mit einer kleinen Menge von Glaswolle (a plug etwa die Hälfte der Größe eines Cent). </li><li class="none"> Swirl komplette G-50-Lösung, um Perlen zu resuspendieren. </li><li class="none"> 2 ml G-50-Lösung in den leeren Spalte. </li><li class="none"> Spin für 1 Minute bei 1.000 x g in Tischzentrifuge. </li><li class="none"> Geben Sie 200 ul DEPC-behandeltem deionisiertem H 2 O in jeder Spalte. Spin. </li><li class="none"> Wiederholen Sie waschen zweimal für insgesamt drei Wäschen. </li><li class="none"> Entfernen Sie Spritze in ein frisches 15 ml konischen Rohr. </li></ul> Collagenase-Lösung <ul><li class="none"> 75 mg Kollagenase aus Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH Puffer <ul><li class="none"> 88 mm NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mm MgSO 4 X 7 H 2 O </li><li class="none"> 0,33 mm Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mm CaCl 2 X 6 H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Oocyte Culture Medium <ul><li class="none"> 50% L15 Medium </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml Insulin </li><li class="none"> 100 mg / ml Gentamicin </li><li class="none"> 50 U / ml Nystatin </li><li class="none"> 50 U / ml Penicillin </li><li class="none"> 50 mg / ml Streptomycin </li></ul> MEMFA Lösung <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% Formaldehyd </li></ul> Computing RNA-Ausbeute <ul><li class="none"> Bestimmen Sie CPM in &quot;Input&quot; und &quot;integriert&quot; Proben mit einem Standard-Szintillationszähler. </li><li class="none"> Einbau = (&quot;eingebaut&quot;) / (10 x &quot;input&quot;) </li><li class="none"> Typische Einbindung Werte zwischen ~ 0,03 und 0,10. </li><li class="none"> Maximale theoretische Ausbeute für verschiedene Polymerasen: T7, T3, SP6 - 2,64 pg </li><li class="none"> Reaktionsausbeute in pg = (maximale Ausbeute von Polymerase) X (Einbau) </li><li class="none"> Verdünnte RNA zu 50 nM = (ug RNA) / 320 / (Länge der RNA in Basen) / (5X10 -8) </li><li class="none"> Die Reaktion ergibt in der Regel ~ 50-100 ul der RNA bei 50 nM. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

RNA-Lokalisierung ist eine konservierte Mechanismus der Gründung Zellpolarität. Vg1 mRNA lokalisiert den vegetativen Pol des Xenopus laevis Oozyten und wirkt räumlich beschränken Genexpression Vg1 Protein. Eine strenge Kontrolle der Vg1 Verteilung auf diese Weise ist für die ordnungsgemäße Keim-Layer-Spezifikation in den sich entwickelnden Embryo erforderlich. RNA-Sequenz-Elemente in der 3 &#39;UTR der mRNA, die Vg1 Lokalisierungselement (VLE) erforderlich und ausreichend, um auf direktem Wege. Zur Untersuchung der Anerkennung und der Transport von Vg1 mRNA in vivo, haben wir ein bildgebendes Verfahren, die umfassende Analyse der trans-Faktor gerichteten Transport-Mechanismen ermöglicht über eine einfache visuelle Ablesung entwickelt. Zur Visualisierung RNA-Lokalisierung, synthetisieren wir fluoreszenzmarkierten VLE RNA und microinject dieses Transkript in einzelne Eizellen. Nach Eizelle Kultur, um den Transport der injizierten RNA zu ermöglichen, sind Eizellen fixiert und dehydriert vor Bildgebung durch konfokale Mikroskopie. Visualisierung der mRNA-Lokalisierung Muster bietet eine Anzeige für die Überwachung der kompletten Pfad der RNA-Transport und für die Ermittlung Rollen in Regie RNA-Transport für cis-wirkende Elemente innerhalb der Transkript-und trans-wirkende Faktoren, die zur VLE (Lewis et al., 2008 zu binden, Messitt et al., 2008). Wir haben diese Technik durch Co-Lokalisation erweitert mit zusätzlichen RNAs und Proteinen (Gagnon und Mowry 2009, Messitt et al., 2008) und in Kombination mit Störungen der motorischen und des Zytoskeletts (Messitt et al., 2008) zur Sonde Mechanismen, die mRNA-Lokalisierung.

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Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualisierung von<em&gt; In vivo</em&gt; RNA-Transport ist durch Mikroinjektion von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte erreicht in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten, gefolgt von der konfokalen Mikroskopie.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

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Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

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In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

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Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

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Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

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Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

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Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

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Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...