Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

העבודה שלנו על לוקליזציה RNA נתמכת על ידי מענק מ-NIH (R01GM071049) כדי KLM.

חלק 1: שעתוק של mRNA שכותרתו fluorescently. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize DNA פלסמיד המכיל את הרכיב לוקליזציה RNA או רצף רלוונטיים אחרים ואת resuspend ב 1 מיקרוגרם / μl עם DEPC שטופלו H 2 O. תבנית ה-DNA חייב להיות מקדם אתרים במעלה עבור שעתוק על ידי T7, SP6, או T3 RNA פול...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

כאן יש לנו הציגה פרוטוקול המאפשר הדמיה לוקליזציה mRNA ב ביציות Xenopus. שיטה זו, באמצעות שכותרתו fluorescently תעתיקי רנ&quot;א יש אות גבוה יחס רעש ממה שהושג בעבר עם digoxigenin שכותרתו תמלילי והוא פשוט יותר מהר מאשר ב-situ גישות מבוסס (Mowry ו מלטון, 1992, Gautreau et al. 1997). באמצעות שיטה זו, אנו י?...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

חיץ 10X Tx <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 מ&quot;מ MgCl 2 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ spermidine-HCl </li></ul> 20x כובע / NTP לערבב <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM CTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM ATP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 מ&quot;מ UTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ GTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ G (PPP) G שווי אנלוגי (ניו אינגלנד Biolabs) </li></ul> G-50 טור <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מימה גרם Sephadex G-50 חרוזים (Sigma Aldrich) ב 100 מ&quot;ל deionized H 2 O. DEPC לטיפול למשך 30 דקות. ו החיטוי. חנות מניות שלם בטמפרטורת החדר. לפני השימוש, מוסיפים את הבאים RNase ללא פתרונות: </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 0.2 M EDTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל 1 M טריס pH 8.0 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 20% SDS </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות להשלים G-50 פתרון ב 4 ° C. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לבטל את הבוכנה של מזרק 3 מ&quot;ל (BD Biosciences) והמקום חבית של המזרק לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל חרוטי (קורנינג). הכנס את המזרק עם כמות קטנה של צמר זכוכית (תוסף בערך בגודל חצי פרוטה). </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים מערבולת ה-G-50 הפתרון resuspend חרוזים. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל G-50 הפתרון בעמודה ריקה. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקה 1 ב 1000 x g בצנטריפוגה benchtop. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl DEPC שטופלו deionized H 2 O כל עמודה. ספין. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעמיים נוספות עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחבית המזרק צינור טרי 15 מ&quot;ל חרוטי. </li></ul> Collagenase פתרון <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 מ&quot;ג collagenase מ Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 מ&quot;ל 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4) </li></ul> MBSH חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 88 mM NaCl </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM KCl </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.4 mM NaHCO 3 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.82 mM MgSO 4 X 7H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.41 mM CaCl 2 X 2 O 6 שעות </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 10 מ&quot;מ (pH 7.6) </li></ul> תרבות הביצית בינוני <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50% L15 בינוני </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 15 מ&quot;מ (pH 7.6) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / ml nystatin </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / ml פניצילין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין </li></ul> MEMFA פתרון <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 מ מגבים (pH 7.4) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ EGTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7% פורמלדהיד </li></ul> מחשוב תשואה RNA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע לאלף הופעות &quot;קלט&quot; ו &quot;שילב&quot; דגימות באמצעות מונה נצנץ סטנדרטי. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב = (&quot;שילב&quot;) / (10 x &quot;קלט&quot;) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב ערכים אופייניים נעים בין ~ 0.03 ו 0.10. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> התשואות התיאורטיות מירבי polymerases שונים: T7, T3, SP6 - 2.64 מיקרוגרם </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת התשואה מיקרוגרם = (תשואה מקסימלית של פולימראז בשימוש) X (שילוב) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל RNA ל 50 ננומטר = (מיקרוגרם RNA) / 320 / (אורך של רנ&quot;א בבסיסי) / (5X10 -8) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה בדרך כלל תשואות ~ 50-100 μl של רנ&quot;א על ​​50 ננומטר. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

לוקליזציה RNA הוא מנגנון שימור של הקמת הקוטביות בתא. Vg1 mRNA localizes לקוטב הצמחי של ביציות Xenopus laevis ופועלת במרחב להגביל ביטוי גנים של חלבון Vg1. פיקוח הדוק של הפצה Vg1 באופן זה נדרש מפרט שכבת נאות נבט בעובר המתפתח. אלמנטים RNA הרצף UTR 3 &quot;של ה-mRNA, את אלמנט Vg1 לוקליזציה (VLE) נדרשים ומספיקים להעביר ישירות. כדי לחקור את ההכרה והובלה של mRNA Vg1 in vivo, פיתחנו טכניקה הדמיה המאפשרת ניתוח נרחב של טרנס גורם מנגנוני הובלה מכוונת דרך readout ויזואלית פשוטה. כדי להמחיש לוקליזציה RNA, אנו לסנתז שכותרתו fluorescently RNA VLE ו microinject זו תעתיק לתוך ביציות בודדים. אחרי תרבות הביצית כדי לאפשר הובלה של RNA מוזרק, ביציות הן קבועות מיובש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ויזואליזציה של דפוסי לוקליזציה mRNA מספק readout לניטור מסלול שלם של רנ&quot;א התחבורה לזיהוי תפקידים בהכוונת RNA תחבורה cis-משחק גורמים בתוך התמליל ואת טרנס משחק הגורמים לאגד את VLE (Lewis et al. 2008, Messitt et al. 2008). הרחבנו את הטכניקה הזו באמצעות לוקליזציה בשיתוף עם RNAs נוספים חלבונים (גניון ו Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), בשילוב עם הפרעה של חלבונים המנוע את cytoskeleton (Messitt et al. 2008) לחקור המנגנונים לוקליזציה mRNA.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

ויזואליזציה של<em&gt; In vivo</em&gt; RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ&quot;א שכותרתו fluorescently לתוך<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...