Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Il nostro lavoro sulla localizzazione di RNA è supportata da una sovvenzione da parte del NIH (R01GM071049) a KLM.

Parte 1: Trascrizione di mRNA fluorescente. <ol><li> Linearizzare DNA plasmidico contenente l&#39;elemento di localizzazione di RNA o altre sequenze pertinenti e risospendere a 1 mg / mL con DEPC trattati con H 2 O. Il modello di DNA deve avere siti promotore a monte per la trascrizione da T7, SP6, o T3 RNA polimerasi. </li><li> Aggiungere i seguenti reagenti in una provetta sterile 1,5 ml: <table><tbody><tr><td> a. Tx tampone 10X (vedi M &amp; M) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> b. 20X tappo / NTP...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Qui abbiamo presentato un protocollo per visualizzare la localizzazione mRNA in ovociti di Xenopus. Questo metodo, utilizzando fluorescente trascrizioni di RNA è più alto rapporto segnale-rumore di quanto precedentemente ottenuti con marcati con digossigenina trascrizioni ed è più semplice e più veloce di approcci basati in situ (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Utilizzando questo metodo, possiamo progettare mutazioni sequenza di RNA e rapidamente test per funzione in vivo. Inoltre, u...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Tx tampone 10X <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM spermidina-HCl </li></ul> 20x cap / NTP mix <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mm UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap analogico (New England Biolabs) </li></ul> G-50 colonna <ul><li class="none"> Idrato 5 g Sephadex G-50 perle (Sigma Aldrich) in 100 ml di acqua deionizzata H 2 O. DEPC-treat per 30 min. e autoclave. Conservare magazzino incompleto a temperatura ambiente. Prima dell&#39;uso, aggiungere il seguente RNasi-free soluzioni: </li><li class="none"> 0,5 ml 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8.0 </li><li class="none"> 0,5 ml 20% SDS </li><li class="none"> Conservare completa soluzione G-50 a 4 ° C. </li><li class="none"> Rimuovere e gettare lo stantuffo da una siringa da 3 ml (BD Biosciences) e posizionare il cilindro della siringa in un tubo da 15 ml (Corning). Collegare la siringa con una piccola quantità di lana di vetro (un tappo circa la metà delle dimensioni di un centesimo). </li><li class="none"> Swirl completo G-50 soluzione per risospendere le sfere. </li><li class="none"> Aggiungere 2 ml di soluzione G-50 alla colonna vuota. </li><li class="none"> Spin per 1 minuto a 1.000 x g in centrifuga da banco. </li><li class="none"> Aggiungere 200 ul DEPC trattati deionizzata H 2 O per ogni colonna. Spin. </li><li class="none"> Ripetere il lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi. </li><li class="none"> Rimuovere il corpo della siringa per un nuovo tubo 15 ml. </li></ul> Collagenasi soluzione <ul><li class="none"> 75 mg di collagenasi da Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH tampone <ul><li class="none"> 88 mm NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 x 7H 2 O </li><li class="none"> 0,33 mm Ca (NO 3) 2 x 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> HEPES 10 mM (pH 7,6) </li></ul> Ovocita Cultura Media <ul><li class="none"> 50% di media L15 </li><li class="none"> HEPES 15 mM (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml di insulina </li><li class="none"> 100 mg / ml di gentamicina </li><li class="none"> 50 U / ml nistatina </li><li class="none"> 50 U / ml di penicillina </li><li class="none"> 50 mg / ml di streptomicina </li></ul> MEMFA soluzione <ul><li class="none"> MOPS 0,1 M (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% di formaldeide </li></ul> Computing RNA resa <ul><li class="none"> Determinare CPM in &quot;input&quot; e &quot;incorporato&quot; campioni utilizzando un normale contatore a scintillazione. </li><li class="none"> incorporazione = (&quot;integrato&quot;) / (10 x &quot;input&quot;) </li><li class="none"> I valori tipici compresi tra incorporazione ~ 0,03 e 0,10. </li><li class="none"> Tenore massimo teorico per polimerasi diverse: T7, T3, SP6 - 2,64 mg </li><li class="none"> Resa di reazione in mg = (resa massima di polimerasi utilizzato) X (incorporazione) </li><li class="none"> Diluire RNA a 50 Nm = (mg RNA) / 320 / (lunghezza di RNA nelle basi) / (5X10 -8) </li><li class="none"> La reazione solitamente produce ~ 50-100 ml di RNA di 50 nm. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

Localizzazione dell&#39;RNA è un meccanismo conservato di stabilire la polarità delle cellule. Vg1 mRNA localizza al polo vegetale ovociti di Xenopus laevis e atti a limitare spazialmente l&#39;espressione genica di VG1 proteine. Stretto controllo VG1 distribuzione in questo modo è richiesto per l&#39;indicazione corretta foglietto embrionale di un embrione in via di sviluppo. Elementi di sequenza di RNA nel 3 &#39;UTR del mRNA, il VG1 elemento di localizzazione (VLE) sono necessari e sufficienti per trasporto diretto. Per studiare il riconoscimento e il trasporto del VG1 mRNA in vivo, abbiamo sviluppato una tecnica di imaging che permette un&#39;analisi approfondita dei trans-fattore di meccanismi di trasporto diretto attraverso una semplice lettura visiva. Per visualizzare la localizzazione di RNA, che sintetizzano fluorescente RNA VLE e microinject questa trascrizione in ovociti individuali. Dopo la cultura degli ovociti per consentire il trasporto del RNA iniettato, gli ovociti vengono fissate e disidratate prima di imaging, microscopia confocale. Visualizzazione di modelli di localizzazione mRNA fornisce una lettura per il monitoraggio del percorso completo di RNA di trasporto e per l&#39;individuazione dei ruoli nel dirigere l&#39;RNA di trasporto per cis-acting elementi all&#39;interno della trascrizione e trans-acting fattori che si legano al VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Abbiamo esteso questa tecnica attraverso la co-localizzazione di RNA e proteine ​​addizionali (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e in combinazione con la rottura del motore e di proteine ​​del citoscheletro (Messitt et al., 2008) di sondare meccanismi alla base di localizzazione mRNA.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizzazione di<em&gt; In vivo</em&gt; RNA di trasporto si ottiene microiniezione di fluorescente trascrizioni di RNA in<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti, seguito dalla microscopia confocale.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...