Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
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RNAの局在に関する私たちの仕事は、KLMにNIH（R01GM071049）からの助成金によってサポートされています。

パート1：蛍光標識mRNAの転写。 <ol><li> RNAの局在化の要素や他の関連配列を含むプラスミドDNAを線形化し、DEPC処理H 2 Oでの1μg/μLで再懸濁します。 DNAテンプレートは、T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼによる転写のための上流のプロモーター部位を持っている必要があります。 </li><li>滅菌1.5mlチューブに下記の試薬を追加します。 <table><tbody><tr><td> A. 10X送信バッファ（M＆Mを参照） </td...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

ここでは、 アフリカツメガエルの卵母細胞におけるmRNAの局在を可視化するためのプロトコルを提示している。蛍光標識RNA転写物を使用して、このメソッドは、以前にジゴキシゲニン標識転写産物を得て、より簡単かつ迅速にその場ベースのアプローチよりもよりも、対ノイズ比の高い信号（モウリーとメルトン、1992、ガウトリューら、1997）があります。この方法を使用して、我々は...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Txバッファ <ul><li class="none"> 60mMのMgCl 2の </li><li class="none"> 400mMのトリス- HCl（pH7.5）で</li><li class="none"> 20 mMのスペルミジン塩酸</li></ul> 20倍キャップ/ NTPミックス <ul><li class="none"> 10mMのCTP </li><li class="none"> 10 mMのATP </li><li class="none"> 9mmのUTP </li><li class="none"> 2mMのGTP </li><li class="none"> 20 mMのG（PPP）Gキャップアナログ（ニューイングランドバイオラボ） </li></ul> G - 50カラム <ul><li class="none"> 100ミリリットル脱イオンH 2 Oの水和物5グラムセファデックスG - 50ビーズ（シグマアルドリッチ） 30分間DEPC -扱います。とオートクレーブ。室温で不完全な在庫を保管してください。ご使用の前に、以下のRNaseフリーのソリューションを追加します。 </li><li class="none"> 0.5ミリリットルの0.2 M EDTA </li><li class="none"> 1mlのMトリスpH8.0 </li><li class="none"> 0.5ミリリットル20％SDS </li><li class="none"> 4℃で完全なG - 50ソリューションを保存する</li><li class="none">取り外して廃棄プランジャーを3 mlのシリンジ（BD Biosciences社）から、15 mlのコニカルチューブ（コーニング）にシリンジの注射筒を配置。グラスウール（ペニーの半分のサイズ約プラグ）の少量の注射器を差し込みます。 </li><li class="none">渦巻き完全なG - 50ビーズを再懸濁させるソリューション。 </li><li class="none">空の列に2ミリリットルG - 50溶液を加える。 </li><li class="none">卓上遠心機で1,000 × gで1分間スピン。 </li><li class="none">各カラムに200μlのDEPC処理脱イオンH 2 Oを追加。スピン。 </li><li class="none"> 3回の洗浄の合計のためにさらに2回洗浄を繰り返します。 </li><li class="none">新鮮な15 mlコニカルチューブにシリンジバレルを取り外します。 </li></ul> コラゲナーゼ溶液 <ul><li class="none"> クロストリジウムヒストリ （シグマアルドリッチ）から75mgのコラゲナーゼ</li><li class="none"> 25ミリリットルの0.1 M KPO 3 +液（pH7.4） </li></ul> MBSHバッファ <ul><li class="none"> 88 mM NaClを</li><li class="none"> 1 mMの塩化カリウム</li><li class="none"> 2.4mmのNaHCO 3を </li><li class="none"> 0.82 mMのMgSO 4を X 7H 2 O </li><li class="none"> 0.33 mMのカルシウム（NO 3）2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0.41 mMのCaCl 2を X · 6H 2 O </li><li class="none"> 10mMのHEPES（pH7.6）で</li></ul> 卵母細胞の培養液 <ul><li class="none"> 50パーセントL15培地</li><li class="none"> 15mMのHEPES（pH7.6）で</li><li class="none"> 1 mg / mLのインスリン</li><li class="none"> 100 mg / mlのゲンタマイシン</li><li class="none"> 50 U / mlのナイスタチン</li><li class="none"> 50 U / mlペニシリン</li><li class="none"> 50 mg / mlストレプトマイシン</li></ul> MEMFAソリューション <ul><li class="none"> 0.1 MのMOPS（pH7.4）に</li><li class="none"> 2mMのEGTA </li><li class="none"> 1 mMのMgSO 4を </li><li class="none"> 3.7％ホルムアルデヒド</li></ul> コンピューティングRNAの収量 <ul><li class="none"> &quot;入力&quot;と標準シンチレーションカウンターを使用して、&quot;法人&quot;のサンプルでCPMを決定します。 </li><li class="none">設立=（&quot;法人&quot;）/（10 ×&quot;入力&quot;） </li><li class="none">典型的な取り込み値は〜0.03と0.10の範囲です。 </li><li class="none">別のポリメラーゼの最大理論収量： T7、T3、SP6 - 2.64μgの</li><li class="none"> μg単位反応収率=（使用されるポリメラーゼの最大収率）X（取り込み） </li><li class="none"> 50nMの=（μgのRNA）/ 320 /（拠点におけるRNAの長さ）にRNAを希釈する/（5 × -8） </li><li class="none">反応は、通常利回り〜50 nmでRNAの50〜100μL。 </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

RNAの局在は、細胞極性の確立に保存されたメカニズムです。 VG1 mRNAはアフリカツメガエルの卵母細胞と空間的にVG1蛋白質の遺伝子発現を制限する行為の植物極に局在化する。この方法でVG1分布の厳密な制御は、発生中の胚の適切な胚層の仕様が必要です。 mRNAの3&#39;UTRのRNA配列の要素は、VG1ローカライズ要素（VLE）は必須と直接輸送するのに十分です。 in vivoで VG1 mRNAの認識と輸送を調べるため、我々は、単純な視覚的な読み出しを経由してトランスファクター向けトランスポートメカニズムの広範な分析を可能にするイメージング技術を開発した。 RNAの局在を可視化するために、我々は、蛍光標識VLEのRNAを合成し、個々の卵母細胞にその写しを顕微注入する。注入されたRNAの輸送を可能にするために卵母細胞の培養後、卵母細胞は、前の共焦点顕微鏡によるイメージングに固定し、脱水です。 mRNAの局在パターンの可視化は、RNAのトランスポートの完全な経路を監視し、シス作用転写内の要素とVLEに結合するトランス作用因子のためにRNAの輸送を指示するの役割を識別するための読み出しを提供する（ルイスら、2008、 Messittら、2008）。我々は、追加のRNAやタンパク質（ギャニオンとモウリー、2009年、Messittら、2008）との共局在を介し​​てこの手法を拡張しており、モーター蛋白質の崩壊と細胞骨格との組み合わせで（Messittら、2008）プローブにmRNAの局在のメカニズム。

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Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

の可視化<em&gt; in vivoで</em&gt; RNAのトランスポートは、蛍光標識RNA転写物のマイクロインジェクションによってに行われます<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞、共焦点顕微鏡に続く。

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

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HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

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顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

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アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

遺伝的変異、短期目標と交配試験場でRNA の形態学的組織コンテキストに点突然変異を可視化

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...