Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
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Nosso trabalho na localização RNA é suportado por uma concessão do NIH (R01GM071049) a KLM.

Parte 1: Transcrição de mRNA fluorescente etiquetado. <ol><li> Linearizar DNA plasmídeo contendo o elemento de localização RNA ou seqüência relevante e ressuspender em 1 mcg / mL com DEPC tratadas com H 2 O. O modelo de DNA deve ter sites de promotor a montante para a transcrição de T7, SP6, ou RNA polimerase T3. </li><li> Adicionar os seguintes reagentes a um tubo de 1,5 ml estéril: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx buffer (ver M &amp; M) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> b. 20X cap / NTP mix (ver ...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Aqui nós apresentamos um protocolo para a visualização de localização mRNA em oócitos Xenopus. Este método, usando transcrições fluorescente etiquetado RNA tem maior relação sinal-ruído do que o anteriormente obtido com marcada com digoxigenina transcrições e é mais simples e mais rápido do que in-situ abordagens baseadas (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos engenheiro RNA mutações sequência e rapidamente teste para função in vivo. Al...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Tx tampão 10X <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM espermidina-HCl </li></ul> 20x mix cap / NTP <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap Analógico (New England Biolabs) </li></ul> G-50 coluna <ul><li class="none"> Hidrato de 5 g Sephadex G-50 contas (Sigma Aldrich) em 100 ml deionizada H 2 O. DEPC de tratamento por 30 min. e autoclave. Loja de ações incompletas em temperatura ambiente. Antes de usar, adicione o seguinte RNase soluções: </li><li class="none"> 0,5 ml 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml SDS 20% </li><li class="none"> Loja completa G-50 solução a 4 ° C. </li><li class="none"> Remover e descartar o êmbolo de uma seringa de 3 ml (BD Biosciences) e colocar o cano da seringa para um tubo cônico de 15 ml (Corning). Ligue a seringa com uma pequena quantidade de lã de vidro (uma ficha cerca de metade do tamanho de uma moeda de um centavo). </li><li class="none"> Redemoinho solução G-50 completa para voltar a suspender contas. </li><li class="none"> Adicionar 2 ml G-50 solução para a coluna vazia. </li><li class="none"> Rodada por 1 minuto a 1000 x g em centrífuga de bancada. </li><li class="none"> Adicionar 200 mL DEPC tratados com H 2 O deionizada para cada coluna. Spin. </li><li class="none"> Repita mais duas vezes para lavar um total de três lavagens. </li><li class="none"> Remover o corpo da seringa para um novo tubo cônico de 15 ml. </li></ul> Solução de colagenase <ul><li class="none"> 75 mg de colagenase Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH tampão <ul><li class="none"> 88 mM NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X </li><li class="none"> 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Meio de Cultura de oócitos <ul><li class="none"> 50% L15 médio </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> Uma insulina mg / ml </li><li class="none"> 100 mg / ml de gentamicina </li><li class="none"> 50 nistatina U / ml </li><li class="none"> 50 U / ml de penicilina </li><li class="none"> 50 mg de estreptomicina / ml </li></ul> MEMFA solução <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> Formaldeído 3,7% </li></ul> Computação rendimento RNA <ul><li class="none"> Determine CPM em &quot;input&quot; e &quot;incorporados&quot; amostras usando um contador de cintilação padrão. </li><li class="none"> incorporação = (&quot;incorporada&quot;) / (10 x &quot;input&quot;) </li><li class="none"> Valores incorporação típicos variam entre 0,03 e 0,10 ~. </li><li class="none"> Rendimentos máximos teóricos para polimerases diferentes: T7, T3, SP6 - 2,64 mg </li><li class="none"> Rendimento da reação em mg = (rendimento máximo de polimerase usada) X (incorporação) </li><li class="none"> Diluir RNA a 50 nM = (mg RNA) / 320 / (comprimento de RNA em bases) / (5X10 -8) </li><li class="none"> A reação geralmente produz ~ 5-10 mL de RNA em 50 nM. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

Localização de RNA é um mecanismo conservado do estabelecimento de polaridade celular. Vg1 mRNA localiza-se o pólo vegetal de oócitos Xenopus laevis e age para restringir espacialmente expressão gênica de Vg1 proteína. Um controlo apertado da Vg1 distribuição desta forma é necessário para especificação apropriada germe camada no embrião em desenvolvimento. Elementos de seqüência RNA na 3 &#39;UTR do mRNA, o elemento de localização Vg1 (VLE) são necessários e suficientes para transporte directo. Para estudar o reconhecimento e transporte de Vg1 mRNA in vivo, temos desenvolvido uma técnica de imagem que permite a análise extensiva de trans-fator de mecanismos de transporte através de uma leitura dirigida visual simples. Para visualizar a localização RNA, podemos sintetizar RNA fluorescente etiquetado VLE e microinject esta transcrição em oócitos individual. Após o cultivo de oócitos para permitir o transporte do RNA injetado, ovócitos são fixos e desidratado antes de imagens por microscopia confocal. Visualização dos padrões de localização mRNA fornece uma leitura para o monitoramento da via completa de RNA de transporte e para a identificação de papéis na direção de RNA de transporte para cis-acting elementos dentro da transcrição e trans-acting fatores que se ligam ao VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nós estendemos esta técnica através de co-localização com RNAs adicionais e proteínas (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e em combinação com a perturbação de proteínas motoras eo citoesqueleto (Messitt et al., 2008) para investigar mecanismos subjacentes localização mRNA.

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Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualização de<em&gt; In vivo</em&gt; RNA de transporte é realizado por microinjeção de transcrições fluorescente etiquetado RNA em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos, seguido por microscopia confocal.

Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

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Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

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Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

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