Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Наша работа по локализации РНК при поддержке гранта NIH (R01GM071049) для KLM.

Часть 1: Транскрипция флуоресцентно меченных мРНК. <ol><li> Линеаризации плазмиды ДНК, содержащей элемент РНК локализации или другие соответствующие последовательности и ресуспендирования на 1 мкг / мкл DEPC обработанных H 2 O. ДНК шаблоне должен быть выше по течению сайтов промотор дл?...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Здесь мы представили протокол для визуализации локализации мРНК в ооцитах Xenopus. Этот метод, с помощью флуоресцентно меченных РНК-транскрипты имеет более высокое отношение сигнал-шум, чем ранее полученные с дигоксигенин меченных стенограммы и проще, и быстрее, чем на месте подход (?...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X буфера Tx <ul><li class="none"> 60 мМ MgCl 2 </li><li class="none"> 400 мМ Трис-HCl (рН 7,5) </li><li class="none"> 20 мМ спермидина-HCl </li></ul> 20x шапка / NTP смеси <ul><li class="none"> 10 мМ CTP </li><li class="none"> 10 мМ ATP </li><li class="none"> 9 мм UTP </li><li class="none"> 2 мМ GTP </li><li class="none"> 20 мМ G (ППС) G Cap аналоговый (New England Biolabs) </li></ul> G-50 колонке <ul><li class="none"> Гидратов 5 г Сефадекс G-50 бусин (Sigma Aldrich) в 100 мл деионизированной H 2 O. DEPC лечению в течение 30 мин. и автоклав. Магазин неполный запас при комнатной температуре. Перед употреблением добавить следующие РНКазы без решения: </li><li class="none"> 0,5 мл 0,2 М ЭДТА </li><li class="none"> 1 мл 1 М Трис рН 8,0 </li><li class="none"> 0,5 мл 20% SDS </li><li class="none"> Магазин полный G-50 решение при 4 ° C. </li><li class="none"> Удаляют поршень от 3 мл шприцем (BD Biosciences) и поместите баррель шприца в 15 мл коническую трубку (Corning). Вставьте шприц с небольшим количеством стекловаты (плагин около половины размера копейки). </li><li class="none"> Swirl полный G-50 решение для ресуспендирования бисером. </li><li class="none"> Добавить 2 мл G-50 решение пустой столбец. </li><li class="none"> Спиновые течение 1 минуты при 1000 х г в центрифуге настольный. </li><li class="none"> Добавить 200 мкл DEPC обработанных деионизированной H 2 O для каждого столбца. Spin. </li><li class="none"> Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок. </li><li class="none"> Удалите шприц баррель до 15 мл свежего коническую трубку. </li></ul> Коллагеназа решение <ul><li class="none"> 75 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 мл 0,1 М КПО 3 + (рН 7,4) </li></ul> MBSH буфер <ul><li class="none"> 88 мМ NaCl </li><li class="none"> 1 мМ KCl </li><li class="none"> 2,4 мМ NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 мМ MgSO 4 x 7H 2 O </li><li class="none"> 0,33 мМ Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 мМ CaCl 2 х 6H 2 O </li><li class="none"> 10 мМ HEPES (рН 7,6) </li></ul> Средний ооцитов культуры <ul><li class="none"> 50% L15 среда </li><li class="none"> 15 мМ HEPES (рН 7,6) </li><li class="none"> 1 мг / мл инсулина </li><li class="none"> 100 мг / мл гентамицина </li><li class="none"> 50 ед / мл нистатина </li><li class="none"> 50 ед / мл пенициллина </li><li class="none"> 50 мг / мл стрептомицина </li></ul> MEMFA решение <ul><li class="none"> 0,1 М MOPS (рН 7,4) </li><li class="none"> 2 мМ EGTA </li><li class="none"> 1 мМ MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% формальдегида </li></ul> Вычислительная РНК выход <ul><li class="none"> Определите CPM в &quot;вход&quot; и &quot;включить&quot; образцы с использованием стандартного сцинтилляционного счетчика. </li><li class="none"> Включение = (&quot;включено&quot;) / (10 х &quot;вход&quot;) </li><li class="none"> Типичные значения включению в диапазоне от ~ 0,03 и 0,10. </li><li class="none"> Максимальная теоретическая доходность для разных полимераз: T7, T3, SP6 - 2,64 мкг </li><li class="none"> Реакция выхода в мкг = (максимальный выход полимеразы используется) X (включение) </li><li class="none"> Развести РНК до 50 нм = (мкг РНК) / 320 / (длина РНК в базах) / (5x10 -8) </li><li class="none"> Реакция обычно дает ~ 50-100 мкл РНК на 50 нм. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

РНК локализация сохраняется механизм формирования клеточной полярности. Vg1 мРНК локализуется на растительном полюса Xenopus laevis ооциты и действует на пространственно ограничить экспрессии генов Vg1 белка. Жесткий контроль Vg1 распределение таким образом, необходимо для правильного выбора слой зародыша в развивающемся эмбрионе. РНК последовательности элементов в 3 &#39;UTR мРНК, Vg1 локализации элемента (VLE) необходимы и достаточны для прямого транспорта. Для изучения признание и транспортировки Vg1 мРНК в естественных условиях, мы разработали изображений метод, который позволяет обширный анализ транс-фактора направлено транспортных механизмов с помощью простого визуального считывания. Чтобы визуализировать локализацию РНК, мы синтезировать флуоресцентно меченных VLE РНК и microinject эту стенограмму в отдельные ооциты. После ооцитов культуры, чтобы перевозки вводили РНК, ооциты являются фиксированными и обезвоженные до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация модели локализации мРНК обеспечивает считывание для мониторинга полный путь РНК транспорта и для выявления роли в управлении РНК транспорта для цис-действующих элементов в стенограмме и транс-действующих факторов, которые связываются с VLE (Lewis и соавт., 2008, Messitt и соавт., 2008). Мы расширили эту технику в рамках совместного с дополнительной локализации РНК и белков (Ганьон и Моури, 2009, Messitt и соавт., 2008), а в сочетании с нарушением моторных белков и цитоскелет (Messitt и соавт., 2008), чтобы исследовать механизмы, лежащие мРНК локализации.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Визуализация<em&gt; В естественных условиях</em&gt; РНК транспорта осуществляется путем микроинъекции флуоресцентно меченных транскриптов РНК в<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов, а затем с помощью конфокальной микроскопии.

Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Патч зажим Запись ионных каналов, выраженные в ооцитов Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Оплодотворение Xenopus ооцитов Использованием метода передачи хост

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

В пробирке транскрипции и укупорки мРНК люциферазы Gaussia Вслед за Трансфекция Сотовые HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Измерение Катионит транспорта по Na, K и H, K-АТФазы<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии: Альтернатива радиоизотопных Анализы

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus ооциты: Оптимизированные методы микроинъекции, Удаление тироцит слоев и быстрые изменения в Решение электрофизиологических экспериментов

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Визуализация генетических вариантов, короткие цели и точечные мутации в контексте морфологических ткани с РНК в Situ гибридизация Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...