Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Vårt arbete med RNA lokalisering stöds av ett bidrag från NIH (R01GM071049) till KLM.

Del 1: Transkribering av fluorescerande mRNA. <ol><li> Linjärisera plasmid-DNA som innehåller RNA lokalisering element eller andra relevanta sekvens och resuspendera vid 1 mikrogram / ​​l med DEPC-behandlade H 2 O. Den DNA-mall måste ha uppströms promotor platser för transkription av T7, SP6, eller T3 RNA-polymeras. </li><li> Lägg till följande reagenser till en steril 1,5 mL rör: <table><tbody><tr><td> A. 10X Tx buffert (se M &amp; M) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> b. 20X keps / NTP mix (se M...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Här har vi lagt fram ett protokoll för visualisering av mRNA lokalisering i Xenopus oocyter. Denna metod, med hjälp av fluorescerande RNA-transkript har högre signal-brus-förhållande än vad som tidigare uppnåtts med digoxigenin märkt studieintyg och är enklare och snabbare än in-situ ansatser (Mowry och Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Med denna metod kan vi ingenjör RNA-sekvens mutationer och snabbt testa för in vivo-funktionen. Vidare genom att använda ytterligare Alexa-UTP fluorof...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Tx buffert <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM spermidine-HCl </li></ul> 20x keps / NTP mix <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mm UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mm G (PPP) G Cap Analog (New England Biolabs) </li></ul> G-50 kolumnen <ul><li class="none"> Hydrate 5 g Sephadex G-50 pärlor (Sigma Aldrich) i 100 ml avjoniserat H 2 O. DEPC-treat i 30 min. och autoklav. Förvara ofullständig lager i rumstemperatur. Före användning, lägg till följande RNase-fria lösningar: </li><li class="none"> 0,5 ml 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml 20% SDS </li><li class="none"> Förvara komplett G-50-lösning vid 4 ° C. </li><li class="none"> Ta bort och kasta kolven från en 3 ml spruta (BD Biosciences) och placera sprutan i en 15 ml konisk tub (Corning). Koppla sprutan med en liten mängd glasull (en plugg ungefär hälften så stor som en krona). </li><li class="none"> Swirl komplett G-50-lösning för att resuspendera kulorna. </li><li class="none"> Tillsätt 2 ml G-50-lösning till den tomma kolumnen. </li><li class="none"> Spin i 1 minut vid 1000 x g som bords centrifugen. </li><li class="none"> Tillsätt 200 l DEPC behandlade avjoniserat H 2 O för varje kolumn. Spin. </li><li class="none"> Upprepa tvätta ytterligare två gånger för sammanlagt tre tvättar. </li><li class="none"> Ta bort sprutan till ett nytt 15 ml koniska rör. </li></ul> Kollagenas lösning <ul><li class="none"> 75 mg kollagenas från Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH buffert <ul><li class="none"> 88 mM NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mm NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 x 7H 2 O </li><li class="none"> 0,33 mm Ca (NO 3) 2 x 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Äggcellen odlingsmedium <ul><li class="none"> 50% L15 medelstora </li><li class="none"> 15 mm HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml insulin </li><li class="none"> 100 mg / ml gentamicin </li><li class="none"> 50 E / ml nystatin </li><li class="none"> 50 E / ml penicillin </li><li class="none"> 50 mg / ml streptomycin </li></ul> MEMFA lösning <ul><li class="none"> 0,1 miljoner MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% formaldehyd </li></ul> Datorer RNA avkastningen <ul><li class="none"> Bestäm CPM i &quot;input&quot; och &quot;införlivas&quot; prover med en vanlig scintillationsräknare. </li><li class="none"> inbyggnad = (&quot;ingå&quot;) / (10 x &quot;input&quot;) </li><li class="none"> Typiska inbyggnad värdena varierar mellan ~ 0,03 och 0,10. </li><li class="none"> Maximala teoretiska avkastningen för olika polymeraser: T7, T3, SP6 - 2,64 mikrogram </li><li class="none"> Reaktion avkastning i mikrogram = (maximal avkastning på polymeras används) X (bolagsordningen) </li><li class="none"> Späd RNA till 50 Nm = (mikrogram RNA) / 320 / (längd RNA i baser) / (5x10 -8) </li><li class="none"> Reaktionen ger oftast ~ 50-100 ìl av RNA vid 50 nm. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

RNA lokalisering är en bevarad mekanism upprättandet cellens polaritet. Vg1 mRNA lokaliserar till växt-polen Xenopus laevis ägg och agerar för att rumsligt begränsa genuttryck av Vg1 protein. Noggrann kontroll av Vg1 fördelning på detta sätt krävs för korrekt grodden lagret specifikationen i det växande embryot. RNA-sekvens element i 3 &#39;UTR av mRNA, den Vg1 lokalisering element (VLE) krävs och tillräckliga för direkt transport. Att studera erkännande och transport av Vg1 mRNA in vivo, har vi utvecklat en bildteknik som gör omfattande analys av trans-faktor riktad transportmekanismer via en enkel visuell avläsning. Att visualisera RNA lokalisering, syntetisera vi fluorescerande VLE RNA och microinject denna utskrift i enskilda oocyter. Efter äggcellen kultur att tillåta transporten av det injicerade RNA, äggceller är fasta och uttorkade innan avbildning av konfokalmikroskopi. Visualisering av mönster mRNA lokalisering ger en avläsning för kontroll hela vägen av RNA transport och för att identifiera roller i regi RNA transport för cis-verkande element i avskriften och trans-verkande faktorer som binder till VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Vi har utvidgat denna teknik genom samarbete lokalisering med ytterligare RNA och proteiner (Gagnon och Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), och i kombination med störningar av motoriska proteiner och cytoskelettet (Messitt et al., 2008) att undersöka mekanismerna bakom mRNA lokalisering.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualisering av<em&gt; In vivo</em&gt; RNA transport sker genom mikroinjektion av fluorescerande RNA-transkript i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyter, följt av konfokalmikroskopiska.

Visualisera RNA lokalisering i Xenopus Oocyter

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Gödsling av Xenopus oocyter Med metoden Host Transfer

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Mätning Cation Transport med Na, K-och H, K-ATPas i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyter med atomabsorptionsspektrofotometri: Ett alternativ till radioisotoper Analyser

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Ansikts Transplantationer i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocyter: optimerade metoder för mikroinjektion, Borttagning av Follikulära cellager, och snabb lösning Förändringar i Elektro Experiment

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualisera genetiska varianter, kort mål och punktmutationer i morfologiska vävnad med en RNA In Situ hybridisering analys

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-typspecifika epigenomet profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...