Name: visualizing rna localization in xenopus oocytes
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

RNA lokalizasyonuna KLM NIH (R01GM071049) bir hibe ile desteklenmektedir.

Bölüm 1: floresan ile işaretlenmiş mRNA Transkripsiyon. <ol><li> Plazmid DNA, RNA yerelleştirme elemanı ya da ilgili diğer dizisi içeren Linearize ve 1 mcg / ml DEPC tedavi H 2 O. ile tekrar süspansiyon DNA şablonu T7, SP6 veya T3 RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için upstream organizatörü sitelerine sahip olması gerekir. </li><li> 1.5mL steril bir tüpe aşağıdaki reaktifler ekleyin: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx tampon (M &amp; M) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> b. 20X kapak /...

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Burada Xenopus oositleri mRNA yerelleştirme görselleştirmek için bir protokol var. Bu yöntem, floresan etiketli RNA transkript kullanarak önceden digoxigenin etiketli transkript ile elde edilen ve in-situ temelli yaklaşımlar (Mowry Melton, 1992, Gautreau ve ark, 1997) daha basit ve daha hızlı daha yüksek sinyal gürültü oranına sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, mühendis dizisi mutasyonlar RNA ve hızlı bir şekilde in vivo fonksiyon testi. Ayrıca, ek Alexa UTP fluorophores kullanarak, ...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Tx tampon <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) </li><li class="none"> 20 mM spermidin-HCl </li></ul> 20x kapak / NTP karışımı <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap Analog (New England Biolabs) </li></ul> G-50 sütun <ul><li class="none"> Hidrat 5 ml 100 g Sephadex G-50 boncuk (Sigma Aldrich) H 2 O. deiyonize 30 dakika DEPC davranın. ve otoklav. Eksik stok oda sıcaklığında saklayın. Kullanmadan önce, aşağıdaki RNaz ücretsiz çözümleri ekleyin: </li><li class="none"> 0.5 ml 0.2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH: 8.0 </li><li class="none"> 0.5 ml% 20 SDS </li><li class="none"> 4 ° C&#39;de tam G-50 çözüm saklayın </li><li class="none"> Çıkartın ve atın piston 3 ml şırınga (BD Biosciences) ve 15 ml konik tüp (Corning) içine şırınga varil. Cam yünü (bir kuruş yarısı boyutu hakkında bir eklenti) küçük bir miktarı ile şırınga takın. </li><li class="none"> Boncuklar tekrar süspansiyon çalkalanarak tam G-50 çözüm. </li><li class="none"> Boş sütun için 2 ml G-50 çözüm ekleyin. </li><li class="none"> 1 dakika için 1.000 x g benchtop santrifüj Spin. </li><li class="none"> 200 ul DEPC tedavi deiyonize H 2 O, her bir sütun ekleyin. Spin. </li><li class="none"> Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın. </li><li class="none"> Yeni bir 15 ml konik tüp şırınga varil çıkarın. </li></ul> Kollajenaz çözüm <ul><li class="none"> Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 75 mg kollajenaz </li><li class="none"> 25 ml 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4) </li></ul> MBSH tampon <ul><li class="none"> 88 mM NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2.4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0.82 mM MgSO 4 X 2 O 7H </li><li class="none"> 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0.41 mM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7.6) </li></ul> Oosit Kültür Orta <ul><li class="none"> % 50 L15 orta </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7.6) </li><li class="none"> 1 mg / ml insülin </li><li class="none"> 100 mg / ml gentamisin </li><li class="none"> 50 U / ml nistatin </li><li class="none"> 50 U / ml penisilin </li><li class="none"> 50 mg / ml streptomisin </li></ul> MEMFA çözümü <ul><li class="none"> 0.1 M MOPS (pH 7.4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> % 3.7 formaldehit </li></ul> Bilgisayar RNA verimi <ul><li class="none"> &quot;Giriş&quot; ve standart bir sintilasyon sayacı kullanarak &quot;anonim&quot; örneklerini BGBM belirleyin. </li><li class="none"> dahil = (&quot;dahil&quot;) / (10 x &quot;giriş&quot;) </li><li class="none"> Tipik kuruluş değerleri ~ 0.03 ve 0.10 arasında değişmektedir. </li><li class="none"> Farklı polimerazları için maksimum teorik verir: T3, T7, SP6 - 2.64 mg </li><li class="none"> Reaksiyon verimi mg = (maksimum verim polimeraz kullanılır) X (dahil) </li><li class="none"> Sulandırınız RNA 50 nM = (mikrogram RNA) / 320 / (üsleri RNA uzunluğu) / (5x10 -8) </li><li class="none"> Reaksiyon genellikle verimi ~ 50 nM RNA 50-100 ul. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

RNA lokalizasyonu hücre polarite kurulması korunmuş bir mekanizma. Vg1 mRNA Xenopus laevis oosit ve mekansal Vg1 protein gen ekspresyonu kısıtlamak için eylemler bitkisel direğe lokalize. Bu şekilde dağılımı Vg1 sıkı kontrol gelişmekte olan embriyonun uygun germ tabakası belirtimi için gereklidir. MRNA 3 &#39;UTR RNA dizisi elemanları, Vg1 yerelleştirme elemanı (VLE) gerekli ve doğrudan ulaşım için yeterli. In vivo Vg1 mRNA tanıma ve taşıma çalışma için, basit bir görsel okuma ile trans-faktör yönelik taşıma mekanizmalarının kapsamlı analizini sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdiler. RNA yerelleştirme görselleştirmek için, floresan etiketli VLE RNA sentez ve bireysel oosit bu transkript microinject. Enjekte edilen RNA taşıma izin oosit kültürü sonra oosit konfokal mikroskobu ile görüntüleme için önce sabit ve kurutulmuş. MRNA yerelleştirme desen Görselleştirme RNA ulaşım tam yol izlenmesi ve cis etkili VLE (Lewis ve ark, 2008 bağlamak transkript ve trans-etkili faktörler içinde unsurları, RNA ulaşım yönlendirmede rolleri tanımlamak için bir okunmasını sağlar Messitt ve ark, 2008). Biz ek RNA ve proteinler (Gagnon ve Mowry, 2009, Messitt ve ark, 2008) ile eş-yerelleştirme yoluyla bu tekniği var ve motor protein ve hücre iskeletinin bozulması ile birlikte prob (Messitt ve ark, 2008) mRNA yerelleştirme altında yatan mekanizmalar.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Görselleştirme<em&gt; In vivo</em&gt; RNA ulaşım floresan etiketli RNA transkript mikroenjeksiyon yapılır<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit, konfokal mikroskobu ile takip.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...