Name: undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

<p class="jove_content"> De auteurs willen graag de hulp van mevrouw Sue Connell erkennen voor haar expertise in hars inbedding en mevrouw Stephania Graven voor haar laboratorium-expertise. De auteurs willen graag professor Frank Kandziora en dr. Marie-Anne Polboth bedanken voor hun advies. </p>

<ol><li> Het weefsel wordt geplaatst in een gesloten container met 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing <sup>3.</sup> Zorg ervoor dat een minimale blootstelling aan licht, als fluorochroom analyse moet worden uitgevoerd, omdat de fluorochromen zijn lichtgevoelig. </li><li> Vast te stellen welke oriëntatie van het weefsel nodig zal zijn. </li><li> Trim het monster op maat, in de juiste richting, met behulp van een lintzaag. Zorg ervoor dat veiligheidsmaatregelen in acht worden genomen. Het monster wordt vervolgens geplaatst in een ondoorz...

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Atlas of Functional Histology</em>. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> <em style='font-style: italic'>J Bone Miner Res</em>. <b>2</b>, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Handbook of histology methods for bone and cartilage</em>. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Theory and Practice of Histological Techniques</em>. , 352-360 (2008).</li></ol>

<u>Oplosmiddelen:</u> <ul><li> 10% Normaal gebufferde formaline, Ethanol, xyleen en butanol zuur <br /> Alle histologie kwaliteit, zwavel vrij. <br /> Grale Wetenschappelijke Pty Ltd <br /> http://www.grale.com.au </li></ul> <u>Schimmels:</u> <ul><li> Afpellen, plastic mallen <br /> Grale Wetenschappelijke </li></ul> <u>Dia&#39;s:</u> <ul><li> SuperFrost PLUS Objectglaasjes <br /> Lomb Wetenschappelijke Pty Ltd <br /> <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> <u>Hars:</u> <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 <br /> Heraeus Kulzer <br /> <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Een back-Block Resin-Technovit 3040 Histo blokkeren <br /> Heraeus Kulzer </li></ul> <u>Vlekken</u> <br /> <span>(Reagentia van Grale Scientific)</span> <p> Goldner&#39;s trichroomkleuring vlek </li><p style="margin-left:40px;"> 1. Weigert de ijzeren hemotoxylin (DeGroat) </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Hemotoxylin oplossing </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Absolute Alcohol </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> b) Iron Solution </td></tr><tr><td> 30% waterige ijzerchloride </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Zoutzuur (geconcentreerd) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> gedestilleerd water </td><td> 95mL </td></tr></table><p style="margin-left:40px;" > Gefilterd en toegevoegd aan gelijk volume van hemotoxylin vlak voor vlek gebruikt. </p><p style="margin-left:40px;" > 2. Ponceau-fuchsine-azophloxin stockoplossingen </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de xylidine oplossing </td></tr><tr><td> Ponceau de xylidine </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> zuur fuchsion </td><td> 0,25 g </td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mix, en voeg gedistilleerd water (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> b) azophloxin oplossing </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mix, en voeg gedistilleerd water (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> c) Definitieve werken vlek oplossing </td></tr><tr><td> Ponceau-fuchsine oplossing </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 0.2% azijnzuuroplossing </td><td> 88mL </td></tr></table><p style="margin-left:40px;"> 3. Licht groene oplossing </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Lichtgroen </td><td> 1g </td></tr><tr><td> azijnzuur </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, en voeg gedistilleerd water (500 ml) </td></tr></table><p style="margin-left:40px;"> 4. Phophomolybdic zuur-Orange G-oplossing </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Fosfomolybdeenzuur </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Oranje G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Los op in 500 ml gedestilleerd water en voeg kristal thymol. </td></tr></table><p> Von Kossa Stain </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% waterige zilvernitraat </td></tr><tr><td> 2,5% natriumthiosulfaat </td></tr><tr><td> 1% safranine O </td></tr></table><p> Alcian blauwe vlek </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian blauw 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% azijnzuuroplossing </td><td> 100 ml </td></tr></table><p> Hemotoxylin en eosine kleuring </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> a) Harris hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Absolute alcohol </td><td> 25ml </td></tr><tr><td> Kalium Alum </td><td> 50g </td></tr><tr><td> gedestilleerd water </td><td> 500ML </td></tr><tr><td> kwikoxide </td><td> 1.25g OR </td></tr><tr><td> Natriumjodaat </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Ijsazijn </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> b) eosine-oplossing </td></tr><tr><td colspan="2"> Commercieel geproduceerde Eosine werd gebruikt. </td></tr></table><p> Alle vlekken dye poeders zijn Gurr kleurstof poeders. <br /> Alle reagentia zijn analytische reagentia, en niet Lab reagentia </p><p> <u>Fluorochromen</u> </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td><br /> Fabrikant </td><td> Fluorchroom </td><td> Catalogus Nummer </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calceïne Green </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarin Complexon </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australië, Victoria </td><td> Oxytetracycline <br /> (Off the shelf antimicrobiële drug) </td><td> Handelsnaam; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

<p class="jove_content"> Undecalcified bot histologie demonstreert de micro-architectuur van het bot. Het toont zowel de gemineraliseerde en cellulaire componenten van het bot, dat vitale informatie over botmetabolisme of botvorming en botresorptie biedt. Dit heeft een enorme betekenis in een verscheidenheid van klinische en wetenschappelijke toepassingen. Het levert prachtige beelden <sup>1</sup> en staat voor technieken zoals fluorochroom beoordeling en histomorfometrie <sup>2.</sup> Fluorochroom analyse is een techniek waarbij fluorescerende kleurstoffen die zich binden aan calcium worden geïnjecteerd op een bepaald tijdstip, dat voor het kwantificeren van de hoeveelheid mineralisatie kan op dat gegeven moment. Histomorfometrie is een proces van bot kwantificering op microscopisch niveau. </p><p class="jove_content"> Het uitvoeren van undecalcified bot histologie is technisch uitdagend, met name bij grote afmetingen exemplaren. Het vereist variaties in de techniek uit die worden gebruikt in standaard paraffine ingebed histologie. Deze video illustreert het proces van het produceren van een goede kwaliteit onderdelen en demonstreert de technische problemen en methoden waarmee ze te overwinnen. Prepareren, fixatie en verwerking worden bereikt met een manier die vergelijkbaar is met andere zachte weefsels, maar door de dichtheid en de lagere permeabiliteit van het bot aanzienlijk langer fixatie en doorlooptijden nodig zijn, vaak het nemen van enkele weken. Inbedding is bereikt met behulp van een ondersteunende medium met soortgelijke of gelijk zijn hardheid en de dichtheid tot op het bot, zoals methacrylaat gebaseerde harsen, maar in tegenstelling tot paraffine infiltratie en inbedding, dit is een onomkeerbare stap. Snijden kan worden bereikt door slijpen die produceert een dikkere deel, dat optimaal is voor studies, zoals fluorchroom analyse. Dit wordt het best bereikt met behulp van een diamant blad op een macrotome. Als alternatief kunnen dunnere gedeelten worden geproduceerd voor lichtmicroscopie en dit is bereikt met behulp van een slede microtoom met een zeer scherp mes. De slee microtoom zorgt voor de extra kracht en stabiliteit die nodig is voor grote, harde blokken. Hars ingebedde coupes kunnen worden gekleurd met een verscheidenheid van vlekken, die zijn aangetoond. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

<p class="jove_content">Undecalcified bot histologie levert belangrijke informatie voor een verscheidenheid aan klinische en wetenschappelijke toepassingen. Het is technisch uitdagend, met name bij grote afmetingen exemplaren. Deze video illustreert het proces van het produceren van een goede kwaliteit onderdelen en demonstreert de technische problemen en methoden waarmee ze te overwinnen.</p>

Undecalcified Bone Voorbereiding voor Histologie, histomorfometrie en fluorchroom Analyse

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Preparation of Adult <em>Drosophila</em> Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

De voorbereiding van Adult<em> Drosophila</em> Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

RNA <em>In situ</em> Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Bone Geconditioneerd Medium: Voorbereiding en Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Een sectie-, coring- en beeldverwerkingshandleiding voor aanschaf en analyse van corticale botmonsters met hoge doorvoer voor Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...