Name: undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

<p class="jove_content"> Författarna vill tacka för stöd av fru Sue Connell för sin expertis i harts inbäddning och Ms Stephania Tombs för hennes laboratorium expertis. Författarna vill tacka Professor Frank Kandziora och dr Marie-Anne Polboth för sina råd. </p>

<ol><li> Vävnaden placeras i en sluten behållare som innehåller 10% fosfatbuffrad formalin lösning <sup>3.</sup> Säkerställa minimal exponering för ljus, om fluorokrom analys skall utföras, eftersom fluorokromer är ljuskänsliga. </li><li> Fastställa vilka orientering av vävnad kommer att krävas. </li><li> Trimma provet storlek, i rätt riktning, med hjälp av en bandsåg. Se till att säkerhetsåtgärder följs. Provet sedan placeras i en genomskinlig behållare, bör vars volym vara cirka tio gånger storleken av provet för att u...

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Atlas of Functional Histology</em>. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> <em style='font-style: italic'>J Bone Miner Res</em>. <b>2</b>, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Handbook of histology methods for bone and cartilage</em>. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Theory and Practice of Histological Techniques</em>. , 352-360 (2008).</li></ol>

<u>Lösningsmedel:</u> <ul><li> 10% Normal buffrat formalin, etanol, xylen och butanol syra <br /> Alla histologi klass, svavelfri. <br /> Grale Vetenskaplig Pty Ltd <br /> http://www.grale.com.au </li></ul> <u>Formar:</u> <ul><li> Skala bort, plastformar <br /> Grale Vetenskapliga </li></ul> <u>Diabilder:</u> <ul><li> SuperFrost PLUS Objektglas <br /> Lomb Vetenskaplig Pty Ltd <br /> <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> <u>Resin:</u> <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 <br /> Heraeus Kulzer <br /> <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Säkerhetskopiera Block Bas-Technovit 3040 Histo-block <br /> Heraeus Kulzer </li></ul> <u>Fläckar</u> <br /> <span>(Reagenser från Grale Scientific)</span> <p> Goldner trikrom fläcken </li><p style="margin-left:40px;"> 1. Weigerts järn hemotoxylin (DeGroat) </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Hemotoxylin lösning </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Absolut alkohol </td><td> 100mL </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> b) Järn-lösning </td></tr><tr><td> 30% vattenlösning järnklorid </td><td> 4ml </td></tr><tr><td> Saltsyra (koncentrerad) </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> destillerat vatten </td><td> 95mL </td></tr></table><p style="margin-left:40px;" > Filtrerad och läggs till motsvarande volym hemotoxylin omedelbart före fläcken används. </p><p style="margin-left:40px;" > 2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stamlösningar </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de xylidin lösning </td></tr><tr><td> Ponceau de xylidin </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> syra fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> Ättiksyra </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Blanda och tillsätt destillerat vatten (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> b) azophloxin lösning </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Ättiksyra </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Blanda och tillsätt destillerat vatten (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> c) Slutlig arbetar bets-lösning </td></tr><tr><td> Ponceau-fuchsin lösning </td><td> 5-10mL </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2ml </td></tr><tr><td> 0,2% ättiksyralösning </td><td> 88mL </td></tr></table><p style="margin-left:40px;"> 3. Ljus grön lösning </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Ljusgrön </td><td> 1g </td></tr><tr><td> ättiksyra </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Blanda och tillsätt destillerat vatten (500ml) </td></tr></table><p style="margin-left:40px;"> 4. Phophomolybdic syra-Orange G-lösning </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Fosformolybdensyra </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Orange G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Lös upp i 500 ml destillerat vatten och tillsätt kristall tymol. </td></tr></table><p> Von Kossa Stain </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% vattenlösning silvernitrat </td></tr><tr><td> 2,5% Natriumtiosulfat </td></tr><tr><td> 1% safranin O </td></tr></table><p> Alcian blånad </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian blå 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% ättiksyra lösning </td><td> 100mL </td></tr></table><p> Hemotoxylin och Eosin fläcken </p><table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> a) Harris hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td> Absolut alkohol </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> Kalium Alum </td><td> 50g </td></tr><tr><td> destillerat vatten </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> kvicksilveroxid </td><td> 1.25g ELLER </td></tr><tr><td> Natriumjodat </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Isättika </td><td> 20ml </td></tr><tr><td colspan="2"  style="font-weight:bold;"> b) Eosin lösning </td></tr><tr><td colspan="2"> Kommersiellt producerade Eosin användes. </td></tr></table><p> Alla fläckar dye pulver Gurr färg pulver. <br /> Alla reagenser är analytiska reagens, och inte Lab reagenser </p><p> <u>Fluorokromer</u> </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td><br /> Tillverkare </td><td> Fluorokrom </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Kalcein Grön </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarin Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australien, Victoria </td><td> Oxytetracyklin <br /> (Från hyllan antimikrobiella läkemedel) </td><td> Handelsnamn; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

<p class="jove_content"> Undecalcified ben histologi visar mikro-arkitektur ben. Det visar både den mineraliserade och cellulära komponenter av ben, som ger viktig information på benomsättning eller benbildning och benresorption. Detta har enorm betydelse i olika kliniska och forskningsansökningar. Det ger vackra bilder <sup>1</sup> och tillåter tekniker såsom fluorokrom bedömning och histomorphometry <sup>2.</sup> Fluorokrom analys är en teknik där fluorescerande färger som binder till kalcium injiceras vid en viss tidpunkt, vilket möjliggör kvantifiering av mängden mineraliseringen vid denna tid. Histomorphometry är en process av ben kvantifiering på mikroskopisk nivå. </p><p class="jove_content"> Utföra undecalcified ben histologi är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Det kräver variationer i tekniken från dem som används i standard paraffininbäddad histologi. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem. Provberedning, fixering och bearbetning uppnås med ett liknande sätt som andra mjuka vävnader, men på grund av densitet och lägre permeabilitet av ben betydligt längre fixering och handläggningstider krävs ofta tar flera veckor. Inbäddning sker med hjälp av en stödjande medium med liknande eller samma hårdhet och täthet till benet som metakrylatbaserade hartser, men till skillnad från paraffin infiltration och bädda, detta är ett oåterkalleligt steg. Sektionering kan uppnås genom slipning som ger en tjockare del, som är optimal för studier som fluorokrom analys. Detta uppnås bäst med hjälp av en diamantklinga på en macrotome. Alternativt kan tunnare tas fram för ljusmikroskopi och detta uppnås med hjälp av en släde mikrotom med en mycket vass kniv. Släden mikrotom ger ytterligare styrka och stabilitet som krävs för stora, hårda block. Resin inbäddade sektioner kan färgas med olika fläckar, som demonstreras. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

<p class="jove_content">Undecalcified ben histologi innehåller viktig information för en rad olika kliniska och forskningsansökningar. Det är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem.</p>

Undecalcified Bone Förberedelse för histologi, Histomorphometry och fluorokrom Analys

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Preparation of Adult <em>Drosophila</em> Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Beredning av vuxna<em> Drosophila</em> Ögon för Thin Sektionering och mikroskopisk analys

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

RNA <em>In situ</em> Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering i hela Mount Embryon och Cell Histologi Anpassad för marina Elasmobranchii

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Bone medium: Förberedelse och bioanalys

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Provberedning för Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning med låg mobilnummer för TEM-analys

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

En sektions-, coring- och bildbehandlingsguide för hög genomströmning När benprovanskaffning och analys för synkrotronmikrotron micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Vävnadsuppsamling och RNA-extraktion från den mänskliga osteoarthritiska knäleden

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Använda realtidscellmetabolisk flödesanalysator för att övervaka osteoblastbioenergetik

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...