Name: mosaic zebrafish transgenesis for evaluating enhancer sequences
Uploaded: 2010-07-16T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences at JoVE.com

<p class="jove_content"> Agradecemos a Sra. Paula Roy para criação de peixe excelente, e Steve Ekker para o presente amável do plasmídeo pDB600. Estes estudos foram financiados por uma doação para SF de NHGRI. </p>

<p class="jove_title"> 1. Seleção e clonagem de sequências conservadas para testes </p><ol><li> É preciso primeiro identificar potenciais seqüências regulatórias para testes funcionais. Contamos com a conservação da sequência evolutiva como critério para selecionar as seqüências, e na maioria das vezes usar o PhastCons algoritmo, que é acessível como uma faixa no navegador Genoma UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). No entanto, existem muitos outros algoritmos disponíveis para avaliar a conservação de seqüência e...

<ol>
	<li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>1</b> (3), 1297-12 (2006).</li><li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS Genet</em>. <b>2</b> (11), e169-169 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>The Zebrafish Book</em>. , (1995).</li></ol>

<p class="jove_content"> Nós demonstramos a abordagem utilizada em nosso laboratório para a análise eficiente de enhancers potencial usando transgênese zebrafish. Na maioria das vezes, usamos esta abordagem de olhar para o tecido-específicas enhancers associados com os genes humanos. Apesar da falta de homologia de seqüência mais óbvia do tempo entre humanos e peixes sequências não codificantes, descobrimos que esta abordagem é geralmente bem sucedido em identificar potenciadores para os genes de interesse para nós. Os fatores crít...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Takara LA Taq</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>RR02M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K2500-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gateway LR Clonase II enzyme Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11791-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DH5&alpha;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12535-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DB3.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11782-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAquick PCR Purification Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic PicoPump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

mosaic zebrafish transgenesis for evaluating enhancer sequences

<p class="jove_content">A conclusão da seqüência do genoma humano, juntamente com a de muitas outras espécies, destacou o desafio de atribuir função específica a não seqüências de codificação. Uma função de destaque realizadas pela fração não-codificante do genoma é regular a transcrição de genes, no entanto, não existem métodos eficazes para prever amplamente cis-regulatórias elementos de seqüência de DNA primária. Nós desenvolvemos um protocolo eficiente para avaliar o potencial funcional cis-regulatórias elementos através de transgênese zebrafish. Nossa abordagem oferece vantagens significativas sobre cultura de células-técnicas baseadas em genes developmentally importante, pois fornece informações sobre regulação do gene espacial e temporal. Por outro lado, é mais rápido e menos dispendioso do que experimentos semelhantes em camundongos transgênicos, e nós rotineiramente aplicá-la a seqüências isoladas do genoma humano. Aqui demonstramos nossa abordagem para selecionar elementos para o teste com base na conservação de seqüência e nosso protocolo para seqüências de clonagem e microinjecting-los em embriões de peixe-zebra.</p>

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

<p class="jove_content">Nós demonstramos a nossa abordagem para encontrar elementos potenciais potenciador de genes regulados developmentally e avaliar a sua função através de transgênese zebrafish mosaico.</p>

Transgénese mosaico Zebrafish de Avaliação Sequências Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Research

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