Name: live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom NIH R01 unterstützt NS042228 zu MCH Die Olympus FV1000 konfokalen mit einem NIH gemeinsame Instrumente zu gewähren S10RR023717 der UW Zoologisches Institut (PI Bill Bement) erworben wurde. Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

1. Versammlung der Injektion Dias und Imaging-Folien Injection Folien: <ol><li> Bereiten Sylgard Silikon-Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie die Sylgard zu binden drei Standard-Objektträger aus Glas zusammen durch das Stapeln einer Folie auf der Oberseite der Kreuzung der beiden anderen Folien, die side-by-side angeordnet sind an den langen Kanten. Der Oberschlitten schafft eine rechtwinklige Ecke oder &quot;Mauer&quot; zwischen oben und unten gleitet. ...

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

Die optimale Konzentration der injizierten DNA variiert je nach Größe und Stärke der Promotor-Konstrukt und sollten empirisch ermittelt werden. Die Injektion von zu viel DNA kann zu ungesunden Embryonen mit umfangreichen Zelltod führen, während zu wenig in einem sehr kleinen Teil der injizierten Embryonen exprimieren das Transgen führen wird. Die DNA-Expression korreliert mit der Stärke des Fluorophor-Signal, das von Zelle zu Zelle variiert. Während Sortierung Embryonen unter Epifluoreszenz, schließen diejenige...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

Der Zebrafisch ist ein ideales Modell für die Bildgebung Zelle Verhaltensweisen während der Entwicklung in vivo. Zebrafisch-Embryos werden extern befruchtet und damit leicht zugänglich in allen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus ermöglicht die optische Klarheit hochauflösende Bildgebung von Zell-und molekulare Dynamik in die natürliche Umgebung des intakten Embryo. Wir sind mit einem Live-Imaging-Ansatz zur Zelle Verhalten während Neuralleiste Zellmigration und das Auswachsen und Führung des neuronalen Axonen zu analysieren. Live-Bildgebung ist besonders hilfreich für das Verständnis der Mechanismen, die Zellbewegung Prozesse regulieren. Zur Visualisierung Details der Zellbewegung, wie protrusive Aktivität und Molekulardynamik, ist es vorteilhaft, einzelne Zellen markieren. In Zebrafisch, ergibt Plasmid-DNA Injektion eine vorübergehende Mosaik Expressionsmuster und bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Zellmarkierung Methoden. Zum Beispiel, transgenen Linien oft label gesamten Zellpopulationen und damit kann die Visualisierung der feinen Vorsprünge (oder Veränderungen in der molekularen Verteilung) in einer einzelnen Zelle im Dunkeln. Darüber hinaus ist die Injektion von DNA in der Ein-Zell-Stadium weniger invasiv und präziser als Farbstoff Injektionen in späteren Phasen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von einzelnen Entwicklungsländern Neuronen oder Neuralleistenzellen und Imaging ihr Verhalten in vivo. Wir injizieren Plasmid-DNA in 1-Zell-Stadium Embryonen, die in Mosaik Transgenexpression Ergebnisse. Die Vektoren enthalten Zell-spezifische Promotoren, fahren die Expression eines Gens von Interesse in einer Untergruppe von sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen. Wir geben Beispiele von Zellen mit Membran gezielt GFP oder mit einem Biosensor-Sonde, die Visualisierung von F-Aktin ermöglicht in lebenden Zellen mit 1 bezeichnet. Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...