Name: live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 NS042228 di MCH I FV1000 Olympus confocale è stata acquisita con una strumentazione NIH condiviso S10RR023717 concedere al Dipartimento di Zoologia UW (PI Bement Bill). Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo articolo.

1. Montaggio di diapositive di iniezione e diapositive di immagini Iniezione di diapositive: <ol><li> Preparare elastomero di silicone Sylgard secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Utilizzare il Sylgard a legare tre microscopio vetro standard diapositive insieme da impilare una diapositiva in cima alla intersezione degli altri due diapositive, che sono disposti fianco a fianco ai bordi lunghi. La slitta superiore crea un angolo retto o &quot;muro&quot; tra la parte superiore e scivo...

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

La concentrazione ottimale di DNA iniettato può variare a seconda delle dimensioni e la forza del promotore costruire e devono essere determinati empiricamente. L&#39;iniezione di DNA troppo può portare a embrioni non sani con la morte delle cellule esteso, mentre troppo poco si tradurrà in una piccola percentuale di embrioni iniettati esprimere il transgene. Il livello di espressione del DNA è correlata con la potenza del segnale fluoroforo, che varia da cellula a cellula. Mentre l&#39;ordinamento degli embrioni so...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

Il pesce zebra è un modello ideale per i comportamenti delle cellule durante lo sviluppo di imaging in vivo. Embrioni di zebrafish sono fecondati esternamente e quindi facilmente accessibile in tutte le fasi di sviluppo. Inoltre, la loro chiarezza ottica permette l&#39;imaging ad alta risoluzione del cellulare e dinamica molecolare in ambiente naturale dell&#39;embrione intatto. Stiamo utilizzando un approccio dal vivo imaging per analizzare i comportamenti delle cellule durante la migrazione delle cellule neurali cresta e la conseguenza e la guida degli assoni neuronali. Immagini dal vivo è particolarmente utile per comprendere i meccanismi che regolano i processi di motilità cellulare. Per visualizzare i dettagli della motilità cellulare, come l&#39;attività protrusiva e dinamica molecolare, è vantaggioso per etichettare le singole celle. In zebrafish, iniezione di DNA plasmidico produce un transitorio pattern di espressione del mosaico e offre vantaggi distinti rispetto ad altri metodi di etichettatura delle cellule. Per esempio, linee transgeniche spesso etichetta popolazioni di cellule intere, e quindi possono oscurare la visualizzazione delle sporgenze fine (o cambiamenti nella distribuzione molecolare) in una singola cella. Inoltre, l&#39;iniezione di DNA alla cellula uno stadio è meno invasiva e più precisa di iniezioni di colorante nelle fasi successive. Qui si descrive un metodo per l&#39;etichettatura di singoli neuroni di sviluppo o cellule della cresta neurale e di imaging il loro comportamento in vivo. Iniettiamo DNA plasmidico in 1 cellula-embrioni fase, che si traduce in espressione del transgene mosaico. I vettori contengono cellule specifiche per i promotori che l&#39;espressione dell&#39;unità di un gene di interesse in un sottogruppo di neuroni sensoriali o cellule della cresta neurale. Forniamo esempi di cellule marcate con GFP membrana mirati o con una sonda biosensore che consente la visualizzazione di F-actina in cellule viventi 1. Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo lavoro.

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Questo protocollo descrive l&#39;imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

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