Name: live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R01 NS042228 till MCH Olympus FV1000 konfokala förvärvades med en NIH gemensamt instrumentering bevilja S10RR023717 till UW Zoologiska institutionen (PI Bill Bement). Erica Andersen, Namrata Asuri, och Matthew Clay bidragit lika för detta dokument.

1. Montering av injektion diabilder och diabilder bildbehandling Injektion diabilder: <ol><li> Förbered Sylgard silikon elastomer enligt tillverkarens anvisningar. </li><li> Använd Sylgard till förbindelsen tre standardglas objektglas tillsammans genom att stapla en bild på toppen av skärningspunkten mellan de andra två bilderna, som ordnas sida vid sida på den långa kanterna. Den översta bilden skapar en rätvinklig hörnet eller &quot;vägg&quot; mellan toppen och botten diabilder....

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

Den optimala koncentrationen av tillförd arvsmassa varierar beroende på storlek och styrka initiativtagaren konstruera och bör bestämmas empiriskt. Injektion av för mycket DNA kan leda till ohälsosamma embryon med omfattande celldöd, medan för lite kommer att resultera i en mycket liten del av injicerade embryon uttrycka transgenen. DNA-uttrycket nivån korrelerar med styrka fluoroforen signalen, som varierar från cell till cell. Även om sorteringen embryon i epifluorescence utesluta de med extremt höga nivå...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

Den zebrafisk är en idealisk modell för beteenden avbildning celler under utvecklingen in vivo. Zebrafisk embryon externt befruktas och därmed lättillgänglig på alla stadier av utveckling. Dessutom tillåter deras optiska klarhet högupplösande avbildning av cell-och molekylär dynamik i den naturliga miljön för den intakta embryot. Vi använder ett levande avbildningsteknik att analysera celler beteenden under neural crest cell migration och utväxt och vägledning av neuronala axoner. Bildproduktion är särskilt användbart för att förstå mekanismerna som reglerar processer cell motilitet. För att visualisera information om cell motilitet, såsom UTSTÅENDE aktivitet och molekylär dynamik, är det fördelaktigt att märka enskilda celler. I zebrafisk, ger plasmid DNA-injektion en övergående mönster mosaik uttryck och ger tydliga fördelar jämfört med andra metoder cell märkning. Till exempel transgena linjerna etikett oftast hela cellpopulationer och därmed kan dölja visualisering av böter utbuktningar (eller förändringar i molekylär distribution) i en enda cell. Dessutom är injektion av DNA i en cell steg mindre invasiv och mer exakt än dye injektioner i senare skeden. Här beskriver vi en metod för märkning av enskilda utvecklingsländer nervceller eller neurala celler crest och bildhantering deras beteende in vivo. Vi injicera plasmid DNA i 1-cell embryon skede, vilket resulterar i mosaik transgenen uttryck. Vektorerna innehåller cell-specifika projektansvariga som driver uttrycket av en gen intresse för en delmängd av sensoriska neuroner och neurala celler krön. Vi ger exempel på celler märkta med membran riktade GFP eller med en biosensor sond som tillåter visualisering av F-aktin i levande celler 1. Erica Andersen, Namrata Asuri, och Matthew Clay bidragit lika för detta arbete.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Detta protokoll beskriver avbildning av enskilda nervceller eller neurala celler crest i levande zebrafisk embryon. Denna metod används för att undersöka cellulära beteenden och aktin lokalisering med hjälp av fluorescens konfokala time-lapse mikroskopi.

Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Mus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) kulturer

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Bildproduktion för cell Extrudering från överhuden av utvecklingsländer Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Studie av Actin cytoskelettet i Live endotelceller uttrycka GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...