Name: robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues
Uploaded: 2010-05-05T17:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues at JoVE.com

Salarissen en ondersteuning van het onderzoek werden door de Verenigde Soja Board, en door de staat en federale fondsen toegerekend aan de Ohio State University / Ohio Agricultural Research and Development Center. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk ondersteund door een beurs van CONACYT, Mexico, aan CMHG. Vermelding van handelsmerk of eigen producten vormt geen garantie of waarborg van het product door OSU / OARDC en impliceert geen goedkeuring aan de uitsluiting van andere producten die ook geschikt kunnen zijn. Tijdschriftartikel Geen HCS 09-17.

De volgende methode schetst een protocol voor het imago van de analyse van genexpressie met behulp van een geautomatiseerd systeem voor het verzamelen afbeelding. Voor het gemak van uitleg, was de algehele aanpak opgesplitst in vier stappen: 1) zaad voorbereiding, 2) gen introductie met behulp van deeltjesbombardement, 3) robot beeldcollectie, en 4) beeldanalyse. Hoewel deze algemene methodiek kan worden gebruikt voor een breed scala van andere toepassingen, zijn de huidige sets van protocollen gebaseerd op het gebruik van het groen fluorescerend eiwit (GFP) gen, dat is een handig reporter gen voor het bijhouden van genexpressie in hetzelfde stuk van levend weefsel in de tijd. I. Seed Voorbereiding <ol><li> Lima boon (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) zaden kunnen worden gekocht, of idealiter geoogst van planten gekweekt in een groeikamer (50% relatieve vochtigheid, 16 / 8 uur licht: donker, 25/23 ° C dag / nacht). Na de oogst zaden kwaliteit kan worden gehandhaafd door het opslaan van zaden bij -20 ° C. </li><li> Bereid Magenta GA7 containers voor kiemende zaden. Vouwen filter papier of papieren handdoeken te passen in de bodem van Magenta dozen. Voeg ~ 25 ml gedeïoniseerd water om elke container op papier handdoeken bevochtigen, en uit niet-geabsorbeerde giet water. Autoclaaf papier-bevattende boxen bevochtigd gedurende 20 minuten. </li><li> Met behulp van 50 ml voor eenmalig centrifugebuizen, steriliseren zaden in een 10% commercieel bleekmiddel-oplossing (20 zaden in 20-40 ml) gedurende 20 min met schudden op een tolbrekers shaker bij 60 rpm. Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. </li><li> Spoel zaden 4-7 keer met steriel gedemineraliseerd water met een zacht schudden 30 seconden tijdens elke spoelen. </li><li> Plaats 5-6 steriele zaden tussen laagjes van gevouwen papier zich in elke steriele Magenta box. </li><li> Incubeer zaden voor 4 dagen onder de volgende voorwaarden: 25 ° C, 16 / 8 uur licht: donker en 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. Gene Inleiding met deeltjesbombardement <ol><li> Bouw genconstructen met behulp van uw favoriete expressievector met een reporter-gen die kunnen worden gecontroleerd in levende weefsels. Wij hebben een hoog kopie-aantal expressievector nuttig voor de promotor en promotor element analyses. Deze vector bevat het GFP-gen die wordt gebruikt om promoter / promotor element functie in getransformeerde weefsel te visualiseren. </li><li> Ongeveer 1-2 uur voor bombardement, accijnzen lima bonen zaadlobben van kiemen zaailingen en verwijder het zaad jassen. Zaadlobben geschikt voor het bombardement moet worden geel aan het licht groen, vlak en vrij van enige schade die zou kunnen interfereren met verdere beeldanalyse. </li><li> Plaats zaadlobben op OMS kweekmedium met MS-zouten een, B5 vitaminen 2, 3% sucrose en 0,2% Gelrite (pH 5,7) onmiddellijk na het weggesneden. </li><li> Neerslaan van de DNA-construct op M10 wolfraam deeltjes (Sylvania, Towanda, PA, USA). In een 0,6 ml microfugebuis, voeg 25 ul wolfraam deeltjes (deeltjes zijn geresuspendeerd in steriel water, 100 mg ml -1, vlak voor gebruik), 5 ul DNA (1 ug ul -1), 25 pi 2,5 M calciumchloride (Sigma -Aldrich Cat. C3881-500G) en 10 pi 100 mM spermidine (Sigma Cat. S-2626). Vortex kort om goed te mengen alle componenten. </li><li> Incubeer de DNA voorbereiding op ijs gedurende 5 minuten. Dan, te verwijderen en gooi 50 ul supernatans. </li><li> Resuspendeer de DNA-gecoate deeltjes door vortexen en onmiddellijk verwijderen van een 2 pi aliquot deel. Herhaal deze vortexen stap iedere keer een hoeveelheid wordt verwijderd uit de buis. Gecoate deeltjes moeten worden bewaard in ijs en binnen 15 minuten. </li><li> Door de bovenkant van een injectiespuit filter, plaats 2 pi gecoate deeltjes in het midden van het filter scherm. Plaats het filter met de gecoate deeltjes in het filter holding unit binnen het deeltje pistool kamer. </li><li> Plaats een lima boon zaadlob adaxial kant naar boven op een baffle en plaats de baffle in het deeltje pistool kamer. De baffle, die bestaat uit een scherm gesmolten op de bodem van een beker, wordt gebruikt als een platform om weefsels te ondersteunen tijdens het bombardement. </li><li> Bombarderen de weefsels met behulp van een Particle Gun (in deze methodiek, gebruiken we een eenvoudige en goedkope Particle Instroom Gun 3, PIG, ontworpen in ons laboratorium) als volgt uit: a) de klep die naar de stofzuiger om de kamer te ontruimen, b) open na het vacuüm bereikt 760 mm (30 in) Hg, activeer de solenoïde en laat de helium om de deeltjes te drijven, c) na deeltjesbombardement, sluit het vacuüm lijn kraan en laat het vacuüm met behulp van de uitlaatklep. De helium druk gebruikt om de deeltjes te versnellen is 50 PSI. </li><li> Nadat het vacuüm wordt vrijgegeven, open de deur naar de kamer gebombardeerd zaadlobben op te halen en tot de terugkeer van de zaadlob, adaxial kant, om OMS kweekmedium. Opmerking: Voor kwantificering en genexpressie, we meestal bombarderen een minimum van drie zaadlobben voor elke DNA-construct. Een positieve controle, wat meestal een DNAconstruct dat geeft een goed bestudeerde gen-expressie profiel, is opgenomen als een referentie. </li></ol> III. Geautomatiseerde Image Collection <ol><li> Zet de kwiklamp en wacht tot 30 minuten voor de lamp is opgewarmd. </li><li> Schakel de stroom bronnen voor de Spot-RT CCD-camera (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI, USA) en de robotica platform motor controller, die de beweging van de robotica platform drives. </li><li> Stel het filter voor GFP-detectie (GFP2 filter in te stellen,.. Ex 480/40 nm, Em 510 LP) op een MZFLIII dissectiemicroscoop (Leica, Heerbrugg, Zwitserland). </li><li> Steriliseer de verdikte polycarbonaat petrischaal deksels door te besproeien met 70% ethanol. De gespecialiseerde deksels, gebruikt ter dekking van de petrischaal basis condensatie te voorkomen tijdens fotocollectie 4. </li><li> Plaats de platen met gebombardeerd zaadlobben op de robotica platform (Arrick Robotica, Hurst, TX, USA) van de geautomatiseerde fotocollectie systeem. De robotica platform wordt aangedreven door een stappenmotor set en bestaat uit een tabel voor de bevestiging van 8 petrischalen. Het platform is opgebouwd uit polycarbonaat, polypropyleen en aluminium. Platen zijn bevestigd in positie door het aandraaien van een laterale plastic set-schroef. </li><li> Open de aangepaste software applicatie die zowel de robotica platform en beeldacquisitie controles. Ook, opent u de software witte licht controller schakelaar. </li><li> In de &quot;motor motion&quot; tab, klik op &quot;motor&quot; en &quot;motor home&quot;. Nadat de software richt het platform om de uitgangspositie, we zijn klaar om te beginnen met het invoeren posities voor elke zaadlob. </li><li> In de &quot;motor motion&quot; tab, selecteer de eerste plaat. Het platform zal de positie van de midden van de petrischaal onder de doelstelling van de microscoop. Met behulp van de bewegende afstand knoppen, juist positie de eerste zaadlob voor beeld collectie. Met het witte licht controller op, kan het doelgebied worden waargenomen door de computer monitor door het aanzetten van de &quot;live-modus&quot;-functie. </li><li> Voor de eerste zaadlob, stelt u de focus en vergroting (1,6 x vergroting heeft de voorkeur) met behulp van de handleiding knoppen op het ontleden microscoop. Focus aanpassingen voor de resterende zaadlobben op dezelfde plaat worden gemaakt met behulp van drie nivelleerschroeven zich onder elk bord, op de robotica platform. </li><li> Zodra het gebied van belang is ingesteld, klikt u op de &quot;add deze positie&quot; te klikken. De software voegt de coördinaten van deze regio naar een positie schema bestand en het platform zal terugkeren naar het midden van de plaat. </li><li> Stel posities en focus voor alle resterende zaadlobben op de borden met de bewegende afstand knoppen en handmatige nivelleerschroeven. Na alle coördinaten van alle de zaadlobben zijn ingevoerd, slaat u de positie schema coördinaten. </li><li> Voer de fotocollectie parameters. In het &quot;beeld instelling&quot; tab, selecteer het type licht gewenst, wit of blauw. Voor GFP detectie, alleen het blauwe licht worden gebruikt. Ook voert u de belichtingsinstelling. Hoewel we kunnen de tijd van de blootstelling onafhankelijk van rode, blauwe en groene kleur te wijzigen, wij gebruiken meestal dezelfde instellingen voor het GFP foto-documentatie (20, 14 en 14 seconden voor rood, groen en blauw kanalen, respectievelijk) waardoor we om directe en consistente vergelijking tussen de verschillende DNA-constructen. </li><li> In dezelfde &quot;beeldinstelling&quot; tab, geef een lege map waarin de afbeeldingen worden opgeslagen. Elke serie beelden worden opgeslagen in deze hoofdmap in onafhankelijke mappen, genummerd opeenvolgend volgens de volgorde van de posities ingeschreven voor zaadlobben. </li><li> Ga naar de &quot;capture time control&quot; tab en stel het beeld overname tijdsinterval en het totale aantal cycli van het beeld collectie. Beelden worden meestal verzameld elk uur voor 100 uur, het genereren van goed gedefinieerde genexpressie profielen. </li><li> Begin beeldacquisitie door te klikken op de &quot;run schema!&quot; knop in het &quot;positie schema&quot; tabblad. </li><li> Aan het einde van de 100 h afbeelding verzameling, overdracht al de beelden van de computer regelen van de robot op een grote capaciteit harde schijf of computer voor verdere beeldanalyse. Beelden met hoge resolutie (1600 x 1200 pixels) worden verzameld als TIF-bestanden te meten ~ 5 Mb per stuk. </li></ol> IV. Beeldanalyse <ol><li> Monteer de 100 opeenvolgende beelden van elke map met behulp van Adobe ImageReady. <ol><li> Open ImageReady en importeer al de opeenvolgende beelden samenstellen van een reeks als frames. </li><li> Resize originele foto&#39;s op 800 x 600 pixels. Verzamelde beelden zijn hoge resolutie, die grote bestanden die kan maken beeldverwerking langzaam genereert. </li><li> Blader door de beelden en zoek een plek (s) zichtbaar in de meeste afbeeldingen. </li><li> Zoom tot 300% op de geselecteerde plek (s). Uitlijning van beelden met behulp van een hogere vergroting zorgt voor een nauwkeuriger registratie. </li><li> Plaats een laag op de top van alle beelden en zorg ervoor dat is zichtbaar in alle frames. Markeer de plek (s) locatie met behulp van de &quot;penseel&quot; tool. </li><li> Beginnen met de aanpassing alle frames met de &quot;move&quot; tool en het nemen van de markeringen op de laag als een referentie. </li><li> Als voltooiing van de aanpassing is, verwijdert de laag gebruikt als een referentie en afbeeldingen opslaan als een enkele &quot;psd&quot; bestand. Ook export alle frames als een enkele &quot;mov&quot; bestand met de hoogste resolutie. Handmatige uitlijning van elk beeld series duurt ~ 10 minuten. </li></ol></li><li> Voer kwantificering van genexpressie met behulp van ImageJ. <ol><li> Open ImageJ software en open de &quot;mov&quot; bestand dat is opgeslagen eerder in ImageReady. </li><li> Met behulp van de te selecteren gereedschap, kies een 400 x 300 pixels gebied en de afbeelding bijsnijden. Dit nieuwe bestand moet worden opgeslagen als een &quot;avi&quot; bestand. </li><li> Scheiden de opeenvolgende beelden, gelegen in het nieuwe &quot;avi&quot; bestand in de rode, blauwe en groene kanalen door te klikken op &quot;beeld&quot;, &quot;kleur&quot; en &quot;RGB split&quot; in ImageJ. </li><li> Trek de achtergrond fluorescentie van alle afbeeldingen in de groene en rode kanalen. Met behulp van het groene kanaal fotoserie, selecteert u een 20 x 20 pixels gebied van een regio met niet-expressie brengen en op te nemen de ligging in de &quot;ROI Manager&quot; tool, zodat het hetzelfde gebied worden geselecteerd in beide kanalen. Met de 20 x 20 pixels vierkant actief in de groene kanaal, ga naar de &quot;plugins&quot; commando in de taakbalk van ImageJ en klik vervolgens op de &quot;trek gemeten ROI voor elk segment&quot; plugin-tool. </li><li> In ImageJ, klik dan op &quot;Image&quot;, &quot;aanpassen&quot; en dan &quot;drempel&quot; te definiëren of het segment van de GFP expressie pixels. Pas de drempel niveaus door het slepen van de bar in de drempel venster om een ​​gemiddelde puntgrootte van 20-30 pixels te verkrijgen. </li><li> Bepaal GFP expressie met behulp van een plugin die we ontworpen voor het meten van de gemiddelde grijswaarde per pixel en het totale aantal van GFP-expressie pixels. </li><li> Kopieer de gemiddelde uitvoer grijswaarden in ImageJ en plakken in Microsoft Office Excel. Bereken de GFP uitdrukking voor elk kanaal (rood en groen) door vermenigvuldiging van de gemiddelde grijswaarde per pixel door het totale aantal van GFP-expressie pixels voor elk kanaal. De som van meningsuiting waarden voor beide kanalen geeft de GFP expressie. Waarden kunnen worden gebruikt om de gen-expressie profielen te illustreren en maken directe vergelijkingen. Time-laps films kunnen ook worden gegenereerd met behulp van &quot;mov&quot; of &quot;avi&quot; bestanden, die een unieke en duidelijke visualisatie van het gen expressie profiel. </li></ol></li></ol> V. representatieve resultaten De robot afbeelding verzamelen en analyseren procedure (afb. 1) hier gerapporteerde maakt de aanschaf van een grote hoeveelheid kwantitatieve gegevens over genexpressie in een korte periode. Voor de plant promotor karakterisering het gebruik van de GFP-gen, deze methodiek is niet alleen nuttig om voorbijgaande expressie profielen aan te maken (afb. 2), maar ook om bij te houden in een gedetailleerde manier GFP-expressie in tijdelijk en stabiel getransformeerde plant weefsels 5,6. Korte time-lapse animatie gegenereerd met de verzamelde opeenvolgende beelden zijn een waardevol instrument voor diepgaande analyses van genexpressie na verloop van tijd in plantaardige weefsels. Deze methodologie heeft ook grote applicatie op factoren die rechtstreeks van invloed zijn genexpressie te evalueren. Zo heeft voorbijgaande GFP expressie onder de aanwezigheid van verschillende onderdrukkers van silencing van virale oorsprong met succes bestudeerd met behulp van onze geautomatiseerde imago verzamelen en analyseren van het systeem 7,8. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Beeldanalyse procedure bestaat uit vier stappen. (A) Overname van het beeld-serie met behulp van de robot afbeelding inzamelsysteem, (B) scheiding van beelden in de rode, blauwe en groene kanalen, (C) segmentatie van het uiten van pixels door het aanpassen van de drempelwaarden, en (D) het verkrijgen van de uitgang resultaten met de grijswaarden en het GFP-expressie richten tellen. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Grafiek verschillende transiënte expressie profielen gedreven door plant promotors gefuseerd met GFP. De gegevens werden verzameld met behulp van onze robot imago opvangsysteem en geanalyseerd met ImageReady en ImageJ software.

<ol>
	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

Het gebruik van robotica is een enorme toepassingen in verschillende aspecten van het menselijk leven, in het bijzonder robots werden effectief gebruikt om activiteiten uit te voeren in gevaarlijke omgevingen, tot vervelend en complexe activiteiten te automatiseren en uit te voeren taken in een meer nauwkeurige manier. In de moleculaire biologie, en specifiek genexpressie analyses, kunnen robots helpen track niet alleen functies van genen, maar ook weefsel groei en ontwikkeling in de tijd. Veel biologische verschijnselen optreden dynamisch, die mogelijk moeilijk te volgen met behulp van een tijdstip waarnemingen. Het gebruik van de GFP-gen voor expressie studies biedt extra voordelen voor het observeren van weefsel respons en groei. Voor onze experimentele procedures, GFP laat ons toe om genexpressie te volgen in hetzelfde stukje weefsel in de tijd als GFP-detectie is een niet-destructief. Bovendien is onze versie van het GFP-eiwit is voldoende stabiel om detectie, maar ook laat zien wat de omzet te minimaliseren accumulatie in plantenweefsels, zodat we zowel de opkomst en ondergang van genexpressie te volgen. We hebben al gebruik gemaakt onze robot imago verzamelen en analyseren van het systeem voor een breed scala aan toepassingen. Wij voorzien een hoog potentieel voor vele biologische toepassingen waar een dynamisch begrip van een fenomeen is gewenst. Zo kan bijvoorbeeld de groei en de ontwikkeling van plantaardige weefsels worden gevolgd met behulp van ons systeem geeft een waardevol inzicht / informatie over deze processen. Ook de dynamiek van eiwit vervoer met reportergenen zoals GFP, kan eenvoudig worden gevisualiseerd met behulp van time-lapse animaties. De methodologie in dit rapport beschreven is technisch ingewikkeld, maar conceptueel eenvoudig. Onze resultaten zijn robuust en nieuwe toepassingen worden voortdurend ontdekt.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

Genexpressie in plantenweefsels is meestal bestudeerd door destructieve extractie van verbindingen uit plantaardige weefsels voor<em&gt; In vitro</em&gt; Analyses. De methoden die hier gebruik maken van het groen fluorescerend eiwit (<em&gt; GFP</em&gt;) Gen voor continue monitoring van genexpressie in dezelfde stukken van weefsels, in de tijd. De<em&gt; GFP</em&gt; Gen werd geplaatst onder regelgevend toezicht van de verschillende promotors en geïntroduceerd in lima bonen cotyledonary weefsels via deeltjesbombardement. Zaadlobben werden vervolgens geplaatst op een robot foto collectie bestaat, welke van een fluorescentie dissectiemicroscoop bestond met een digitale camera en een 2-dimensionale robotica platform speciaal ontworpen om veilige bevestiging van de cultuur gerechten mogelijk te maken. Beelden werden verzameld uit cotyledonary weefsels elk uur 100 uur tot expressie profielen genereren voor elke promotor. Elke verzamelde serie van 100 beelden werd voor het eerst onderworpen aan een manuele beelduitlijning met behulp van ImageReady om er zeker van dat GFP-expressie foci consequent werden bewaard worden in geselecteerde terreinen van de analyse. Specifieke regio&#39;s van de serie meet 300 x 400 pixels, werden vervolgens geselecteerd voor verdere analyse om GFP Intensity metingen met behulp van ImageJ software aan te bieden. Batch beelden werden gescheiden in de rode, groene en blauwe kanalen en GFP-expressie gebieden werden geïdentificeerd met behulp van de drempel kenmerk van ImageJ. Na aftrek van de achtergrond fluorescentie (aftrekken van de grijswaarden van de niet-expressie pixels van elke pixel) in de respectieve rode en groene kanalen, werd GFP intensiteit berekend door vermenigvuldiging van de gemiddelde grijswaarde per pixel door het totale aantal van GFP-expressie pixels in elk kanaal, en vervolgens toe te voegen deze waarden voor zowel de rode en groene kanalen. GFP Intensity waarden werden verzameld voor alle 100 punten tijd tot expressie profielen opleveren. Variaties in GFP expressie profielen gevolg van verschillen in factoren als promotor sterkte, de aanwezigheid van een suppressor zwijgen, of de aard van de promotor. Naast de kwantificering van GFP intensiteit, waren de foto-serie ook gebruikt om time-lapse animaties met behulp van ImageReady te genereren. Time-lapse animatie is gebleken dat de duidelijke meerderheid van de cellen een relatief snelle stijging van de GFP expressie, gevolgd door een langzame afname weergegeven. Sommige cellen af ​​en toe verschijnt een plotseling verlies van fluorescentie, die gepaard kan gaan met een snelle celdood. Schijnbare transport van GFP over het membraan en celwand naar aangrenzende cellen werd ook waargenomen. Time lapse animaties verstrekte aanvullende informatie die anders niet kon worden verkregen met behulp van GFP Intensity profielen of enkel tijdstip beeldcollecties.

Watch this Scientific Journal Video about Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues at JoVE.com

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

We brengen verslag uit een methode voor de introductie, tracking en kwantitatieve analyse van de GFP expressie in plantencellen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen robotica systeem voor semi-continue foto collectie van grote aantallen monsters, in de tijd. We tonen ook aan het gebruik van ImageJ en ImageReady voor de analyse van foto-serie.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrofysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...