Name: murine model of cd40-activation of b cells
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Wij danken dr. Clemens Wendtner voor het aanbieden van tmuCD40-Ligand-HeLa cellijn.

Het protocol voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen (mCD40B) van splenocyten is verdeeld in twee delen: deel A toont de bereiding van de muizen-CD40 ligand (CD40L) uitdrukken HeLa cellen (tmuCD40L HeLa), die zal worden gebruikt als plaat- gebonden feeder cellen. Deel B beschrijft de actuele muis CD40-B cultuur. A. Bereiding van feeder-cellen (tmuCD40L HeLa) De tmuCD40L HeLa is een aanhanger menselijke epitheel cellijn, die nooit zou moeten worden ...

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk, vooral wat betreft de oorsprong van CD40-stimulus en het type muizenstam gebruikt, ook in waardoor een efficiënte generatie muizen CD40-geactiveerde B-cellen. Ahmadi et al.. hebben gelijkwaardige resultaten getoond voor muizen fibroblasten getransfecteerd met murine CD40-ligand. In deze context presentatie van xeno-antigeen kan met zekerheid worden uitgesloten, maar intensieve studies met betrekking tot de veiligheid en toxiciteit in vivo gaf geen tekenen van ontstek...

A. Bereiding van Media: <table border="1"><tbody><tr><td> Feeder cel wild-type medium </td><td> Feeder celselectie medium </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 300 ug / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 300 ug / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycine B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B wassen medium </td><td> mCD40-B kweekmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 580 ug / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 580 ug / ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Diverse Reagentia: <table border="1"><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Volgnummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Geen kat H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Select </td><td> Art No 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Geen kat DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Geen kat S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> PAA </td><td> Geen kat P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant muizen Interleukine-4 </td><td> Immunotools </td><td> Geen kat 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Geen kat NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. diverse benodigdheden: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Volgnummer </td></tr><tr><td> Steriele pipet tips </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-well plaat </td><td> NUNC </td><td> Geen kat 140675 </td></tr><tr><td> 50ml conische buis </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Geen kat 352070 </td></tr><tr><td> Weefselkweek fles </td><td> Sarstedt </td><td> Geen kat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

Onderzoek naar de B-cellen heeft aangetoond dat CD40 activatie van hun antigeen presentatie vermogen verbetert. Wanneer gestimuleerd met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L), kunnen menselijke B-cellen worden uitgebreid zonder de moeilijkheden van kleine hoeveelheden van perifeer bloed binnen 14 dagen de tijd om zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellen per patiënt) van gezonde donoren en patiënten met kanker<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B-cellen express belangrijk lymfeklier homing moleculen en kan aantrekken T-cellen<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Verder zijn ze efficiënt opnemen, verwerken en presenteren antigenen aan T-cellen<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-B-cellen werd aangetoond dat niet alleen de prime naïef, maar ook uit te breiden geheugen T-cellen<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Daarom is CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B-cellen) zijn bestudeerd als een alternatieve bron van immuno-stimulerende antigen-presenterende cellen (APC) voor cel-gebaseerde immunotherapy1, 5,10. Om verdere onderzoeken of CD40-B-cellen effectief T-cel responsen te induceren in vivo en de onderliggende mechanisme dat we een celcultuur ingevoerde systeem voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen te bestuderen. Met behulp van splenocyten of gezuiverd B-cellen van C57BL / 6 muizen voor CD40-activering, werden optimale condities geïdentificeerd als volgt: Vanaf splenocyten van C57BL / 6 muizen (haplotype H-2b) lymfocyten worden gezuiverd door dichtheidsgradiënt centrifugatie en co-gekweekt met HeLa cellen die recombinant muizen CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Cellen worden recultured elke 3-4 dagen en de belangrijkste componenten zoals CD40L, interleukine-4,-mercaptoethanol en ciclosporine A worden aangevuld. In dit protocol hebben we laten zien hoe je volledig geactiveerd muis CD40-B-cellen (mCD40B) te verkrijgen met vergelijkbare APC-fenotype van de menselijke CD40-B-cellen (Fig 1a, b). CD40-stimulatie leidt tot een snelle uitgroei en uitbreiding van zeer zuiver (&gt; 90%) CD19 + B-cellen binnen 14 dagen na celkweek (afb. 1c, d). Om te voorkomen dat besmetting met niet-getransfecteerde cellen, expressie van de muizen-CD40-ligand op de transfectanten moet regelmatig worden gecontroleerd (afb. 2). Muizen CD40-geactiveerde B-cellen kunnen worden gebruikt voor het B-cel activatie en differentiatie, alsook onderzoek om hun potentieel te onderzoeken om te functioneren als APC in vitro en in vivo. Bovendien, zij vertegenwoordigen een veelbelovend instrument voor het vaststellen van de therapeutische of preventieve vaccinatie tegen tumoren en zal helpen om vragen met betrekking tot veiligheid en immunogeniciteit van deze aanpak te beantwoorden<sup&gt; 12</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Murine Model of CD40-activation of B cells (Video) | JoVE

In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells (Video) | JoVE

Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells (Video) | JoVE

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Murine Model of Allergen Induced Asthma (Video) | JoVE

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plaque Assay for Murine Norovirus (Video) | JoVE

Plaque assay voor Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells (Video) | JoVE

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells (Video) | JoVE

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization (Video) | JoVE

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function (Video) | JoVE

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro (Video) | JoVE

Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells (Video) | JoVE

In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...