Name: murine model of cd40-activation of b cells
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09
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Nous remercions le Dr Clemens gentiment Wendtner pour fournir lignée cellulaire tmuCD40-Ligand-HeLa.

Le protocole pour la génération de cellules murines B CD40-activé (mCD40B) à partir de splénocytes est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation d&#39;murin CD40 ligand (CD40L) exprimant des cellules HeLa (HeLa tmuCD40L), qui sera utilisé comme plate- liés cellules nourricières. Partie B décrit la réelle murin CD40-B de la culture. A. Préparation de cellules nourricières (tmuCD40L HeLa) Les cellules HeLa tmuCD40L est une adhérente lig...

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	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Modifications de ce protocole sont possibles, notamment sur l&#39;origine du CD40-stimulus et le type de souche de souris utilisée, également dans la production à rendement efficace de cellules murines B CD40-activé. Ahmadi et al. ont montré des résultats similaires pour les fibroblastes de souris transfectées avec CD40-ligand murin. Dans ce contexte de présentation xéno-antigènes peut être exclu avec certitude, mais des études intensives concernant la sécurité et la toxicité in vivo a donné auc...

A. Préparation des médias: <table border="1"><tbody><tr><td> Cellules nourricières type de support sauvages </td><td> Milieu de sélection de cellules Feeder </td><td></td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 300 pg / mL </td><td> L-Glutamine </td><td> 300 pg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycine B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B milieu de lavage </td><td> mCD40-B milieu de culture </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 580 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 580 pg / ml </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Le glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Réactifs Divers: <table border="1"><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> AAP </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Sélectionnez Delta </td><td> Art Pas 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Aucun chat DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> AAP </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> AAP </td><td> Aucun chat P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant murin interleukine-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Cat No 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Fournitures diverses: <table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr><td> Stérile pipette </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-même la plaque </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tube conique </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> Aucun chat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

La recherche sur les cellules B CD40 a montré que l&#39;activation améliore leur capacité de présentation antigénique. Lorsqu&#39;ils sont stimulés par l&#39;interleukine-4 et CD40 ligand (CD40L), les lymphocytes B humains peut être étendu sans difficulté à partir de petites quantités de sang périphérique dans les 14 jours pour très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que des patients atteints de cancer<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Cellules CD40-B expriment des molécules importantes ganglion homing et peuvent attirer les cellules T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. En outre, ils prennent efficacement, le processus et présentent les antigènes aux cellules T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Cellules CD40-B ont été montrés pour non seulement naïve écoute, mais également d&#39;élargir la mémoire des lymphocytes T<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Par conséquent CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été étudiés comme une source alternative de l&#39;immuno-stimulation des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) à base de cellules immunotherapy1, 5,10. Afin d&#39;étudier plus avant si les cellules CD40-B induisent des réponses efficaces cellules T in vivo et d&#39;étudier le mécanisme sous-jacent, nous avons établi un système de culture cellulaire pour la génération de cellules murines B CD40-activé. Utiliser splénocytes ou purifiée cellules B de souris C57BL / 6 pour les CD40-activation, les conditions optimales ont été identifiées comme suit: A partir de splénocytes de souris C57BL / 6 (haplotype H-2b) de lymphocytes sont purifiées par centrifugation sur gradient de densité et de co-cultivées avec des cellules HeLa cellules exprimant recombinant murin CD40-ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Les cellules sont repiquées tous les 3-4 jours et les composants clés tels que CD40L, l&#39;interleukine-4,-mercaptoéthanol et la cyclosporine A sont reconstituées. Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé murin CD40-cellules B (mCD40B) avec APC-phénotype similaire aux humains CD40 des cellules B (figure 1a, b). CD40-stimulation conduit à une excroissance rapide et l&#39;expansion de la très pure (&gt; 90%) CD19 + cellules B dans les 14 jours de culture cellulaire (figure 1c, d). Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l&#39;expression du ligand CD40 murin sur les transfectants doit être contrôlée régulièrement (figure 2). Murin CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B et la différenciation ainsi que d&#39;étudier leur potentiel de fonctionner comme APC in vitro et in vivo. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour l&#39;établissement de la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs et aideront à répondre aux questions concernant la sécurité et l&#39;immunogénicité de cette approche<sup&gt; 12</sup&gt;.

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Murine Model of CD40-activation of B cells (Video) | JoVE

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d&#39;activation de CD40-et à l&#39;expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d&#39;antigène (APC) pour étudier l&#39;induction de l&#39;immunité.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

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