Name: murine model of cd40-activation of b cells
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Wir danken Dr. Clemens Wendtner für die Bereitstellung tmuCD40-Ligand-HeLa-Zelllinie.

Das Protokoll für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen (mCD40B) von Splenozyten ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von Maus-CD40-Ligand (CD40L) exprimierende HeLa-Zellen (tmuCD40L HeLa), die als verwendet werden Platten- Feeder-Zellen gebunden. Teil B beschreibt die eigentliche murine CD40-B Kultur. A. Herstellung von Feeder-Zellen (tmuCD40L HeLa) Die tmuCD40L HeLa ist ein Anhänger menschlichen epithelialen Zell-Linie, die nie ...

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Änderungen dieses Protokolls sind möglich, insbesondere über die Herkunft der CD40-Stimulus und die Art der Maus-Stamm verwendet, auch Nachgeben in effiziente Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen. Ahmadi et al. haben gezeigt, ähnliche Ergebnisse für Maus-Fibroblasten mit murinen CD40-Ligand transfiziert. In diesem Zusammenhang Präsentation der Xeno-Antigen kann mit Sicherheit ausgeschlossen werden, aber intensive Studien hinsichtlich Sicherheit und Toxizität in vivo gab keine Anzeichen für eine ...

A. Herstellung der Medien: <table border="1"><tbody><tr><td> Feeder Zelle Wildtyp-Medium </td><td> Feeder Zelle Selektionsmedium </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 300 ug / mL </td><td> L-Glutamin </td><td> 300 ug / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0,2 mg / mL </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B Waschmedium </td><td> mCD40-B Kulturmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 580 pg / mL </td><td> L-Glutamin </td><td> 580 pg / mL </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / mL </td><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Sonstige Reagenzien: <table border="1"><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Bestell-Nr </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Select </td><td> Art.-Nr. 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Cat No DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES-Puffer </td><td> PAA </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> Cat No P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant Murine Interleukin-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporin A </td><td> Novartis </td><td> Cat No NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Sonstiges Zubehör: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Bestell-Nr </td></tr><tr><td> Sterile Pipettenspitzen </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Rohr </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche </td><td> Sarstedt </td><td> Cat No 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

Forschung auf B-Zellen haben gezeigt, dass CD40-Aktivierung ihrer Antigen-Präsentation Kapazität verbessert. Wenn mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L) stimuliert, kann das menschliche B-Zellen ohne Schwierigkeiten von kleinen Mengen von peripheren Blut innerhalb von 14 Tagen bis sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (erweiterbar&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs-Patienten<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B-Zellen exprimieren wichtige Lymphknoten homing-Molekülen und können T-Zellen zu gewinnen<em&gt; In-vitro-</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Darüber hinaus sie effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T-Zellen<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-B-Zellen wurden nicht nur prime naiv dargestellt, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Deshalb CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle untersucht immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für zellbasierte immunotherapy1, 5,10. Zur weiteren Untersuchung, ob CD40-B-Zellen effektiv T-Zell-Antworten induziert in vivo und den zugrunde liegenden Mechanismus haben wir eine Zellkultur-System für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen zu studieren. Mit Splenozyten gereinigt oder B-Zellen aus C57BL / 6 Mäuse für CD40-Aktivierung wurden optimale Bedingungen wie folgt gekennzeichnet: Ausgehend von Splenozyten von C57BL / 6 Mäuse (Haplotyp H-2b) Lymphozyten sind durch Dichtegradientenzentrifugation und co-kultiviert mit HeLa gereinigt Zellen, die rekombinante murine CD40-Ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Die Zellen werden rekultiviert alle 3-4 Tage und Schlüsselkomponenten wie CD40L, Interleukin-4,-Mercaptoethanol und Cyclosporin A werden wieder aufgefüllt. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert murine CD40-B-Zellen (mCD40B) mit ähnlichen APC-Phänotyp für die menschliche CD40-B-Zellen (Abb. 1a, b) zu erhalten. CD40-Stimulation führt zu einer raschen Folge und Erweiterung von hochreinem (&gt; 90%) CD19 + B-Zellen innerhalb von 14 Tagen Zellkultur (Abb. 1c, d). Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen, ist Ausdruck des murinen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig kontrolliert werden (Abb. 2). Murine CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung und Differenzierung sowie Studien, um ihr Potenzial zu untersuchen Funktion als APC in vitro und in vivo werden. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für den Aufbau therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren und wird dazu beitragen, Fragen zur Sicherheit und Immunogenität dieses Ansatzes Antwort<sup&gt; 12</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Murine Model of CD40-activation of B cells

In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...