Name: murine model of cd40-activation of b cells
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Мы любезно благодарит д-р Клеменс Wendtner за предоставление tmuCD40-лиганд-клеточной линии HeLa.

Протокол поколение мышиных CD40-активированных В-клеток (mCD40B) из спленоцитов делится на две части: часть демонстрирует подготовку мышиной CD40 лиганда (CD40L), выражающая HeLa клетки (tmuCD40L HeLa), который будет использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерных клеток. Часть В описывает факти...

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Модификации данного протокола возможны, особенно в отношении происхождения CD40-стимул и тип мыши напряжение используется, также уступая в эффективной генерации мышиной CD40-активированных В-клеток. Ахмади соавт. показали аналогичные результаты для мышиных фибробластов, трансфицирован?...

А. Подготовка носителя: <table border="1"><tbody><tr><td> Устройство подачи ячейки диких среднего типа </td><td> Устройство подачи клеточной селекции средой </td><td></td></tr><tr><td> Реагент </td><td> Концентрация </td><td> Реагент </td><td> Концентрация </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> 300 мкг / мл </td><td> L-глютамин </td><td> 300 мкг / мл </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 мМ </td><td> HEPES </td><td> 10 мМ </td></tr><tr><td> Гентамицин </td><td> 15 мкг / мл </td><td> Гентамицин </td><td> 15 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Гигромицину B </td><td> 0,2 мг / мл </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B промыванием </td><td> mCD40-B культуральной среде </td></tr><tr><td> Реагент </td><td> Концентрация </td><td> Реагент </td><td> Концентрация </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> 580 мкг / мл </td><td> L-глютамин </td><td> 580 мкг / мл </td></tr><tr><td> Глюкоза </td><td> 4,5 мг / мл </td><td> Глюкоза </td><td> 4,5 мг / мл </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 мМ </td><td> HEPES </td><td> 10 мМ </td></tr><tr><td> Гентамицин </td><td> 15 мкг / мл </td><td> Гентамицин </td><td> 15 мкг / мл </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 мм (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> Б. Разное Реагенты: <table border="1"><tr><td> Реагент </td><td> Компания </td><td> Приказ № </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> ПАА </td><td> Cat Нет H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Дельта Выберите </td><td> Нет искусства 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Кошка не DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES буфера </td><td> ПАА </td><td> Cat Нет S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Гигромицину B </td><td> ПАА </td><td> Cat Нет P02-015 </td></tr><tr><td> Рекомбинантный интерлейкин мышей-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat Нет 12340045 </td></tr><tr><td> Циклоспорин </td><td> Novartis </td><td> Кошка не NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Трипсина / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> С. Различные системы: <table border="1"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Компания </td><td> Приказ № </td></tr><tr><td> Стерильные наконечники </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-луночный планшет </td><td> Nunc </td><td> Cat Нет 140675 </td></tr><tr><td> 50 мл коническую трубку </td><td> BD Сокол ™ </td><td> Cat Нет 352070 </td></tr><tr><td> Колбу культуры ткани </td><td> Sarstedt </td><td> Кошка не 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

Исследование клеток показало, что CD40 активации улучшает их презентации антигена мощности. При стимуляции с интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L), человеческих клеток может быть расширена без трудностей из небольшого количества периферической крови в течение 14 дней до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Клеток на пациента) от здоровых доноров, а также у больных раком<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B клетки экспрессируют важно лимфатических узлов самонаведения молекул и может привлекать Т-клетки<em&gt; В пробирке</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Кроме того, они эффективно заниматься, обрабатывать и представлять антигены Т-клеткам<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-лимфоциты были показаны не только простые наивные, но и расширяют ячеек памяти T<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Поэтому CD40-активированных В-клеток (CD40-лимфоцитов) были изучены в качестве альтернативного источника иммуно-стимулирующего антиген-представляющих клеток (АПК) для клеточной immunotherapy1, 5,10. В целях дальнейшего исследования ли-CD40 В-клеток индуцировать эффективный Т-клеточные реакции в естественных условиях и для изучения основной механизм мы создали систему культуры клеток для создания мышиной CD40-активированных В-клеток. Использование спленоцитов или очищенной В-клеток C57BL / 6 мышей для CD40-активации, оптимальные условия были определены следующим образом: Начиная с спленоцитов C57BL / 6 мышей (гаплотип H-2b) лимфоциты очищают центрифугирования в градиенте плотности и со-культивировали с HeLa клеток, экспрессирующих рекомбинантный мышиный CD40 лиганд (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Клетки recultured каждые 3-4 дня и ключевые компоненты, такие как CD40L, интерлейкин-4,-меркаптоэтанол и циклоспорин пополняются. В этом протоколе мы покажем, как получить полностью активирована мышиной CD40-лимфоцитов (mCD40B) с аналогичными APC-фенотип человека к CD40-лимфоцитов (рис. 1а, б). CD40-стимуляция приводит к быстрому нарост и расширения высокой чистоты (&gt; 90%), CD19 +-клеток в течение 14 дней культуры клеток (рис. 1в, г). Во избежание загрязнения с неправительственными организациями, трансфицированных клеток, экспрессия мышиного CD40 лиганда на трансфектантов должен находиться под контролем регулярно (рис. 2). Мышиного CD40 активированных В-клеток может быть использована для изучения В-клеточной активации и дифференциации, а также исследовать их потенциал, чтобы функции, как APC в пробирке и в естественных условиях. Более того, они представляют собой перспективный инструмент для создания терапевтических или профилактических прививок против опухолей и поможет ответить на вопросы относительно безопасности и иммуногенности этого подхода<sup&gt; 12</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Murine Model of CD40-activation of B cells

В этом видео мы продемонстрируем процедуру активации CD40 и расширение мышиных клеток из спленоцитов C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в качестве модели антиген-представляющих клетки (АПК) для изучения индукции иммунитета.

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Индукция и оценка класса Рекомбинация коммутатор в Очищенная мышиные клетки B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Мышиной модели астма Аллерген Индуцированные

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Бляшек на мышиной норовирус

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Мышиной модели группы B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Вагинальный Колонизация

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...