Name: murine model of cd40-activation of b cells
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09
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Amablemente las gracias al Dr. Clemens Wendtner para proporcionar tmuCD40-ligando línea celular HeLa.

El protocolo para la generación de murino CD40-linfocitos B activados (mCD40B) a partir de esplenocitos se divide en dos partes: la parte A demuestra la preparación de murino CD40 ligando (CD40L) que expresan las células HeLa (tmuCD40L HeLa), que se utiliza como placa- obligados células alimentadoras. La parte B describe la actual murino CD40-B cultura. A. Preparación de las células de alimentación (tmuCD40L HeLa) El HeLa tmuCD40L es un adherente línea huma...

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	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Las modificaciones de este protocolo son posibles, especialmente en relación con el origen de CD40-estímulo y el tipo de cepa de ratón utilizada, también está dando en la generación eficiente de las células B CD40 murino activado. Ahmadi et al. han mostrado resultados similares para los fibroblastos de ratón transfectadas con CD40 murino-ligando. En este contexto de la presentación de xeno-antígeno puede ser excluido con certeza, pero los estudios intensivos sobre la seguridad y la toxicidad in vivo n...

A. Preparación de los medios de comunicación: <table border="1"><tbody><tr><td> Alimentador de medio celular de tipo salvaje </td><td> Alimentador de selección de células medianas </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración </td><td> Reactivo </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 300 mg / mL </td><td> L-Glutamina </td><td> 300 mg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Higromicina B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B medio de lavado </td><td> mCD40 B-medio de cultivo </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración </td><td> Reactivo </td><td> Concentración </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 580 mg / ml </td><td> L-Glutamina </td><td> 580 mg / ml </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glucosa </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Otros reactivos: <table border="1"><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de orden </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> No gato H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Seleccione Delta </td><td> Arte No 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Gato No DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampón HEPES </td><td> PAA </td><td> No gato S11-001 </td></tr><tr><td> MEM AANE </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> PAA </td><td> No gato P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinante murino interleucina-4 </td><td> Immunotools </td><td> Gato No 12340045 </td></tr><tr><td> La ciclosporina A </td><td> Novartis </td><td> No NDC 0078-0109-01 gato </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA (10 veces) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Otros materiales: <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de orden </td></tr><tr><td> Puntas de pipeta estériles </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 y placa </td><td> NUNC </td><td> Gato No 140675 </td></tr><tr><td> Tubo cónico de 50 ml </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Gato No 352070 </td></tr><tr><td> Frasco de cultivo de tejidos </td><td> Sarstedt </td><td> Gato No 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

La investigación sobre células B CD40 ha demostrado que mejora la capacidad de activación de la presentación de antígenos. Cuando se estimula con la interleucina-4 y CD40 ligando (CD40L), las células B se puede ampliar sin problemas a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica dentro de 14 días a cantidades muy grandes de muy pura de células B CD40-(&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Células por paciente) de donantes sanos, así como los pacientes con cáncer<sup&gt; 4.1</sup&gt;. Las células CD40-B expresan importantes moléculas mensajeras de los ganglios linfáticos y puede atraer a las células T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Además se ocupan de manera eficiente, procesar y presentar antígenos a los linfocitos T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Las células CD40-B mostraron no sólo ingenuo principal, sino también ampliar las células T de memoria<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Por lo tanto-CD40 activan las células B (CD40-células B) se han estudiado como una fuente alternativa de inmuno-estimulantes de células presentadoras de antígeno (APC) para celulares basado en immunotherapy1, 5,10. Con el fin de estudiar más a fondo si las células CD40-B induce respuestas eficaces de las células T in vivo y para estudiar el mecanismo subyacente que estableció un sistema de cultivo celular para la generación de células B CD40 murino activado. Utilizando esplenocitos o purificada células B de ratones C57BL / 6 para la activación de CD40-, las condiciones óptimas fueron identificados de la siguiente manera: A partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6 (haplotipo H-2b) los linfocitos se purificaron por centrifugación en gradiente de densidad y co-cultivadas con células HeLa células que expresan el ligando de CD40 murino recombinante (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Las células son recultured cada 3-4 días y los componentes clave, tales como CD40L, la interleucina-4,-mercaptoetanol y ciclosporina A se repone. En este protocolo se demuestra cómo obtener completamente activado murino CD40-células B (mCD40B) con similares APC-fenotipo en humanos CD40-células B (Fig. 1a, b). CD40-estimulación conduce a un resultado rápido y la expansión de alta pureza (&gt; 90%) las células B CD19 + en los 14 días de cultivo de células (Fig. 1c, d). Para evitar la contaminación con células no transfectadas, la expresión del ligando de CD40 murino en los transfectantes tiene que ser controlado regularmente (Fig. 2). Murino CD40-linfocitos B activados se pueden utilizar para estudiar activación de células B y la diferenciación, así como para investigar su potencial para funcionar como APC in vitro e in vivo. Además, representan una herramienta prometedora para el establecimiento de la vacunación terapéutica o preventiva contra los tumores y le ayudará a responder a las preguntas relativas a la seguridad y la inmunogenicidad de este enfoque<sup&gt; 12</sup&gt;.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Modelo murino de asma inducida por alergenos

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Placa de Ensayo para Norovirus murino

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

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Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

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Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

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A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

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Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

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En Vitro modelo de diferenciación de células de memoria humana Normal B a células plasmáticas duradero

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