Name: multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Dr. Pramod Nehete und Frau Bharti Nehete für Makaken Blut und PBMC-Proben; Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus NIH AI 46969 unterstützt, und alle Zellkulturmedien wurden von der Zentralen Media Laboratory hergestellt, die von NIH CA finanziert wird 16672.

1) Zellpräparation und antigene Stimulation, 2) Surface Marker-Färbung, 3) Intrazelluläre Zytokinfärbung und 4) Durchflusszytometrie: Die Verfahren für die detaillierte phänotypische und funktionelle Analysen von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von T-Zellen lassen sich in vier Teile geteilt werden Analysen. 1. Handy Vorbereitung und Antigenstimulation <ol><li> Beide frisch isolierten als auch kryokonserviert peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) wurden in diesem Pro...

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

Lösung und Puffer <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> RPMI-1640 Medium (HyClone Labors, Logan, UT) </li><li> Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone Labors, Logan, UT) </li><li> L-Glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Penicillin / Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Trypanblau-Reagenz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> 50 mM Tris, pH 8,6, filtriert und bei 4 ° C </li><li> Dulbecco PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life Technologies, Rockville, MD) </li><li> Flow-Waschpuffer: DPBS Ergänzung mit 2% FBS, Lagerung bei 4 ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilisierung Solution Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Activation Agenten <ul><li> Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Kostimulatorischen mAb CD49d, Klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> Affinity gereinigte Antikörper F (ab) 2-Fragmente von Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard und Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) </li><li> Spezifische Aktivierung Agenten könnten Peptid-Pools, einzelnes Peptid oder Protein ganze </li></ul> Zytokinsekretion Inhibitoren <ul><li> Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Golgi-Plug können alternativ verwendet werden (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Antibodies <ul><li> Live / Dead fixierbar aqua Fluoreszenzfarbstoff-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD28 PerCP-Cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

Die Rhesusaffen-Modell ist derzeit das beste verfügbare Modell für HIV-AIDS in Bezug auf das Verständnis der Pathogenese sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Hier beschreiben wir eine Methode für die detaillierte phänotypische und funktionelle Analysen von zellulären Immunantworten, insbesondere intrazelluläre Zytokin-Produktion von CD4 + und CD8 + T-Zellen als auch die individuelle Erinnerung Teilmengen. Wir erhalten präzise quantitative und qualitative Maßnahmen für die Produktion von Interferon-gamma (INF-) und Interleukin (IL) -2 in beiden CD4 + und CD8 + T-Zellen aus dem Rhesusaffen PBMC mit PMA und Ionomycin (PMA + I) stimuliert. Das Zytokin-Profile wurden verschiedene in den verschiedenen Untergruppen von Speicherzellen. Darüber hinaus lieferte dieses Protokoll uns die Empfindlichkeit auch kleinere Fraktionen von Antigen-spezifischen CD4 + demonstrieren und CD8 + T-Zell-Subsets innerhalb der PBMC-Proben von Rhesusaffen mit einer HIV-Envelope-Peptid-Cocktail-Impfstoff in unserem Labor entwickelt immunisiert. Die Multicolor-Durchflusszytometrie-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um genau zu identifizieren verschiedene Populationen von T-Zellen<sup&gt; 4,5</sup&gt; Mit Zytokin-produzierende Funktion<sup&gt; 6</sup&gt; Folgende unspezifische oder Antigen-spezifische Stimulation<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Wir demonstrieren den Nutzen des multicolor Durchflusszytometrie für detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von CD4 + und CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen, das ideale Modell für HIV / AIDS-Impfstoff-Studien.

Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...