Name: multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

ד&quot;ר פרמוד Nehete וגברת Bharti Nehete דם מקוק דגימות PBMC; עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי כספים NIH מענק AI 46969, וכל תרבות התקשורת התא הופקו על ידי התקשורת המרכזית מעבדה, אשר ממומנת על ידי מענק NIH CA 16672.

הנהלים עבור ניתוחים פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון ותאי T ניתן לחלק לארבעה חלקים: 1) הכנה Cell וגירוי antigenic, 2) סמן Surface מכתים, 3) מכתים ציטוקינים תאיים ו 4) cytometry זרימה מנתח. 1. תא הכנה גירוי antigenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

פתרון Buffers <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI-1640 בינוני (HyClone מעבדות, לוגן, UT) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרום שור עוברית (FBS), (HyClone מעבדות, לוגן, UT) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-גלוטמין (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen; בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypan כחול מגיב (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס, PH 8.6, מסוננים ולאחסן ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dulbecco של PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; החיים טכנולוגיות, Rockville, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיץ זרימה: תוספת DPBS עם 2% FBS, לאחסן ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BD Cytofix / Cytoperm קיבוע / Permeabilization פתרון Kit (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li></ul> הפעלת סוכנים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ionomycin (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Costimulatory MAB CD49d, לשבט 9F10 (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיקה מטוהרים נוגדן F (ab) 2 שברי אנטי עכבר עיזים IgG (H + L) (קירקגור ופרי מעבדה, Gaithersburg, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת סוכנים ספציפיים עשויים לכלול בריכות פפטיד, פפטידים אחד, או חלבון שלם </li></ul> הפרשת ציטוקינים מעכבי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Brefedin (BFA, סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס Golgi ניתן להשתמש לחילופין (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li></ul> נוגדנים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חי / מת ערכת ניתן לתקן אקווה כתם ניאון (Invitrogen; בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 פסיפיק בלו (OKT4), (eBiosciences (סן דייגו, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

המודל מקוק רזוס היא כיום מודל זמין הטוב ביותר עבור איידס ביחס להבנת הפתוגנזה, כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. כאן אנו מתארים שיטה מנתח פנוטיפי ופונקציונלי מפורט של התגובה החיסונית התאית, ייצור ציטוקינים תאיים במיוחד על ידי CD4 + ו - CD8 + T תאים, כמו גם את תת זיכרון הפרט. השגנו באמצעים כמותיים ואיכותיים מדויק לייצור אינטרפרון גאמא (INF-) ו - interleukin (IL) -2 מסוג CD4 + ו שניהם CD8 + T תאים PBMC מקוק רזוס מגורה עם PMA פלוס ionomycin (PMA + I). פרופילים ציטוקינים היו שונים תת שונים של תאים בזיכרון. יתר על כן, פרוטוקול זה סיפק לנו את הרגישות להפגין אפילו שברים קטנים של אנטיגן ספציפי CD4 + ו - CD8 + T תת תא בתוך דגימות PBMC מ קופי רזוס לחסן עם חיסון פפטידי קוקטייל איידס המעטפה שפותחו במעבדה שלנו. הטכניקה cytometry ססגוניות זרימה הוא כלי רב עוצמה לזהות במדויק אוכלוסיות שונות של תאים T<sup&gt; 4,5</sup&gt; עם יכולת ייצור ציטוקינים<sup&gt; 6</sup&gt; בעקבות הגירוי הלא ספציפית או אנטיגן ספציפי<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...