Name: multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00
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Dr. Pramod Nehete e Sra. Bharti Nehete de sangue e amostras de PBMC macaco; Este trabalho foi parcialmente financiado com recursos do NIH AI 46969 conceder, e todos os meios de cultura de células foram produzidos pelo Laboratório Central de Mídia, que é financiado pelo NIH conceder CA 16672.

Os procedimentos para a análise detalhada fenotípica e funcional do total, bem como subconjuntos de memória das células T pode ser dividido em quatro partes: 1) a preparação de células e estimulação antigênica, 2) coloração da superfície marcador, 3) coloração de citocinas intracelulares e 4) citometria de fluxo análises. 1. Preparação celular e estimulação antigênica <ol><li> Ambos os recém-isoladas, bem como crio-preservado células mononucleares do sangue periféri...

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

Solução e Buffers <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> RPMI-1640 meio (HyClone laboratórios, Logan, UT) </li><li> Soro fetal bovino (FBS), (HyClone laboratórios, Logan, UT) </li><li> L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Penicilina estreptomicina / (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Trypan azul reagente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> 50 mM Tris, pH 8,6; filtrada e armazenar a 4 ° C </li><li> PBS Dulbecco (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life Technologies, Rockville, MD) </li><li> Buffer de fluxo de lavagem: suplemento DPBS com 2% de SFB, armazenar a 4 ° C </li><li> BD Fixação Cytofix / Cytoperm / permeabilização Solution Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Agentes de ativação <ul><li> Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Ionomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Co-estimulação mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> Afinidade de anticorpos purificados F (ab) 2 fragmentos de cabra anti-camundongo IgG (H + L) (Kierkegaard e Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) </li><li> Agentes específicos de ativação poderia incluir piscinas peptídeo, único peptídeo ou proteína inteira </li></ul> Secreção de inibidores de citocinas <ul><li> Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Ligue Golgi pode ser usado alternativamente (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Anticorpos <ul><li> Vivo / morto fixable aquática kit fluorescente mancha (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD28-PerCP cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

O modelo de macaco rhesus é atualmente o melhor modelo disponível para o HIV-AIDS com respeito à compreensão da patogênese, bem como para o desenvolvimento de vacinas e terapêutica<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Aqui, descrevemos um método para a análise detalhada fenotípica e funcional das respostas imunes celulares, especificamente a produção de citocinas intracelulares por células CD4 + e CD8 + T, bem como os subconjuntos de memória individual. Obtivemos precisas medidas quantitativas e qualitativas para a produção de interferon gama (INF-) e interleucina (IL) -2 em ambos os CD4 + e CD8 + T células do PBMC rhesus estimuladas com PMA mais ionomicina (PMA + I). Os perfis das citocinas foram diferentes nos diferentes subgrupos de células de memória. Além disso, este protocolo forneceu-nos a sensibilidade para demonstrar, mesmo frações menores de CD4 antígeno específico + e CD8 + subpopulações de células T dentro do PBMC amostras de macacos rhesus imunizadas com uma vacina contra o HIV cocktail envelope peptídeo desenvolvido em nosso laboratório. O multicolor técnica de citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa para identificar precisamente as diferentes populações de células T<sup&gt; 4,5</sup&gt; Com a produção de citocinas, capacidade<sup&gt; 6</sup&gt; Após a estimulação não-específica ou antígeno específico<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

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Imunologia e Infecção

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Sete Passos para Stellate Células

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Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia<sup&gt; +</sup&gt; Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

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Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...