Name: multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Доктор Прамод Nehete и миссис Bharti Nehete для макаки крови и РВМС образцов; Эта работа была частично поддержана за счет средств гранта NIH А.И. 46969, и все средства массовой информации культуре клеток были произведены Центральной Media Laboratory, которая финансируется за счет гранта NIH CA 16672.

Процедуры для подробного фенотипических и функциональных анализов от общего числа, а также памяти подмножества Т-клеток может быть разделена на четыре части: 1) подготовка клеток и антигенной стимуляции, 2) Поверхность маркер окрашивание, 3) внутриклеточные окрашивания цитокинов и 4) Пр?...

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

Решение и буферы <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) </li><li> RPMI-1640 (Hyclone лабораторий, Logan, UT) </li><li> Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), (Hyclone лабораторий, Logan, UT) </li><li> L-глутамина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) </li><li> Пенициллин / стрептомицин (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния) </li><li> Трипановый синего реагента (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) </li><li> 50 мМ Трис, рН 8,6, фильтруют и хранят при температуре 4 ° C </li><li> Дульбеко PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Жизнь технологий, Роквилл, штат Мэриленд) </li><li> Поток промывочного буфера: DPBS дополнения с 2% ЭТС, хранят при температуре 4 ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm Фиксация / пермеабилизации Решение Kit (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li></ul> Активация агентов <ul><li> Форбол 12-миристат-13-ацетат (PMA) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) </li><li> Иономицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) </li><li> Костимуляторных мАт CD49d, клон 9F10 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li><li> Affinity очищенные антитела F (аb) 2 фрагментов антимышиного IgG (H + L) (Кьеркегор и Перри лаборатории, Gaithersburg, MD) </li><li> Специальные агенты могут включать в себя активацию пептид бассейнов, один пептид, или общий белок </li></ul> Ингибиторы секреции цитокинов <ul><li> Brefedin (БФА, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) </li><li> Гольджи Плагин также можно использовать (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li></ul> Антитела <ul><li> Live / мертвых поправимо аква флуоресцентные пятна комплект (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния) </li><li> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li><li> CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (Сан-Диего, Калифорния) </li><li> CD8 Alexa700 (РПА-T8), (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li><li> CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li><li> ИЛ-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

Резус-макаки модель в настоящее время наилучшие имеющиеся модели для ВИЧ-СПИД в отношении понимания патогенеза, а также для разработки вакцин и методов лечения<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Здесь мы опишем метод подробную фенотипические и функциональный анализ клеточных иммунных реакций, в частности, внутриклеточное продукцию цитокинов CD4 + и CD8 + Т-клеток, а также отдельные подмножества памяти. Мы получили точные количественные и качественные показатели для производства гамма-интерферона (ИФН) и интерлейкин (IL) -2 в CD4 + и CD8 + Т-клеток от резус-макаки РВМС стимулированных PMA плюс иономицина (PMA + I). Цитокинов профили были различными в разных подмножествах ячеек памяти. Кроме того, данный протокол дает нам чувствительность, чтобы продемонстрировать даже незначительные доли антиген специфических CD4 + и CD8 + Т-клеток подмножества в РВМС образцы из макак-резус, иммунизированных пептидом ВИЧ конверт коктейль вакциной, разработанной в нашей лаборатории. Цитометрии многоцветной поток техника представляет собой мощный инструмент, чтобы точно определить различные популяции Т-клеток<sup&gt; 4,5</sup&gt; С цитокин-производственные мощности<sup&gt; 6</sup&gt; Следующий неспецифические или антиген-специфической стимуляции<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Мы демонстрируем полезность многоцветной проточной цитометрии для подробного фенотипические и функциональные характеристики от общего числа, а также памяти подмножеств CD4 + и CD8 + Т-клеток у макак-резус, идеальная модель для борьбы с ВИЧ / СПИД исследования вакцины.

Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup&gt; +</sup&gt; Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Одноклеточных Quantitation мРНК и поверхности белков в инфицированных Обезьяний вирус иммунодефицита CD4+ T клетки изолированы от макак резус

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...