Name: multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00
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Dr. Pramod Nehete y la señora Bharti Nehete de sangre y muestras de PBMC macacos; Este trabajo fue financiado parcialmente con fondos del NIH AI 46969, y todos los medios de cultivo celular fueron producidos por el Laboratorio Central de los medios de comunicación, que es financiado por el NIH subvención CA 16672.

Los procedimientos para el análisis detallado fenotípica y funcional de la total, así como subconjuntos de células T de memoria se puede dividir en cuatro partes: 1) la preparación celular y la estimulación antigénica, 2) tinción de la superficie marcador, 3) tinción intracelular de citoquinas y 4) La citometría de flujo análisis. 1. Preparación de células y la estimulación antigénica <ol><li> Ambos recién aisladas, así como la crio-preservado las células mononucleares de...

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

Solución y Buffers <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> RPMI-1640 (Hyclone Laboratories, Logan, UT) </li><li> Suero fetal bovino (FBS), (Hyclone Laboratories, Logan, UT) </li><li> L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Penicilina / estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> El azul tripán reactivo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> 50 mM Tris, pH 8,6; filtrar y almacenar a 4 ° C </li><li> Dulbecco PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free, Life Technologies, Rockville, MD) </li><li> Flujo de tampón de lavado: suplementos DPBS con FBS al 2%, se almacenan a 4 ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm fijación / permeabilización solución Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Agentes de la activación <ul><li> Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Ionomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Coestimuladoras AcM CD49d, clon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> Purificado por afinidad del anticuerpo F (ab &#39;) 2 fragmentos de cabra anti-ratón IgG (H + L) (Kierkegaard y Perry laboratorio, Gaithersburg, MD) </li><li> Agentes específicos de activación podría incluir piscinas péptido, solo péptido o proteína entera </li></ul> Inhibidores de la secreción de citoquinas <ul><li> Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) </li><li> Plug Golgi se puede utilizar como alternativa (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Anticuerpos <ul><li> Live / Dead corregibles aqua fluorescentes kit de tinción (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> PE-CD3 Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD28-PerCP Cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

El modelo de macaco rhesus es actualmente el mejor modelo disponible para el VIH-SIDA con respecto a la comprensión de la patogénesis, así como para el desarrollo de vacunas y terapias<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Aquí se describe un método para el análisis detallado fenotípica y funcional de la respuesta inmune celular, específicamente la producción de citoquinas intracelulares de las células CD4 + y CD8 + T, así como los subconjuntos de la memoria individual. Se obtuvieron precisa medidas cuantitativas y cualitativas para la producción de interferón gamma (IFN-) y la interleuquina (IL) -2 en ambos CD4 + y CD8 + T las células de los macacos rhesus PBMC estimuladas con PMA más ionomicina (PMA + I). Los perfiles de citoquinas fueron diferentes en los diferentes subconjuntos de células de memoria. Además, este protocolo nos dio la sensibilidad para demostrar incluso fracciones menores de CD4 + antígeno específico y CD8 + subconjuntos de células T en las muestras de PBMC de macacos rhesus inmunizados con una vacuna contra la envoltura del VIH cóctel péptido desarrollado en nuestro laboratorio. El flujo multicolor técnica de citometría es una poderosa herramienta para identificar con precisión las diferentes poblaciones de células T<sup&gt; 4,5</sup&gt; Con la capacidad de producción de citoquinas<sup&gt; 6</sup&gt; Después de la estimulación no específica o antígeno-específicas<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Demostrar la utilidad de la citometría de flujo multicolor para la caracterización detallada fenotípica y funcional de la total, así como la memoria subconjuntos de células CD4 + y CD8 + T en macacos rhesus, el modelo ideal para estudios de vacunas contra el VIH / SIDA.

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

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