Name: comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part i: lignin
Uploaded: 2010-03-11T16:00:00
Duration: 12 min 4 s
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Somos gratos a Matthew Robert Weatherhead para excelente serviço técnico e John Ralph, da Universidade de Wisconsin para conselhos valiosos, discussões e amostra de madeira de álamo. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Energia dos EUA (DOE) dos Grandes Lagos Centro de Pesquisa em Bioenergia (DOE BER Escritório de Ciência DE-FC02-07ER64494) e pelas Ciências Química, Geociências e Biociências Divisão do Escritório de ciências básicas da energia, o Office of Science , Departamento de Energia dos EUA (sem prêmio. DE-FG02-91ER20021).

1. Isolamento da parede celular <ol><li> Moer cerca de 60-70mg de ar ou liofilizados material vegetal com 5,5 milímetros esferas de aço inoxidável em um tubo de 2 ml Sarstedt tampa de rosca usando um iWall, um robô de moagem e distribuição (30 s). Uma alternativa não-robótica procedimento de baixo rendimento utilizando um moinho de bolas (retschmill) é apresentada na Parte II 2. </li><li> Adicionar 1,5 ml de 70% de etanol aquoso para o material do solo dispensado, e vortex completamente. </li><li> Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min para sedimentar o resíduo de álcool insolúveis. </li><li> Aspirar ou decantar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1,5 ml de solução de clorofórmio / metanol (1:1 v / v) ao resíduo do tubo e agitar cuidadosamente para ressuspender o sedimento. </li><li> Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min e Aspirar ou decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender pellet em 500 mL de acetona. </li><li> Evaporar o solvente com um fluxo de ar a 35 ° C até secar. Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento. </li><li> Para iniciar a remoção do amido da amostra ressuspender o sedimento em 1,5 ml de sódio 0,1 M tampão acetato pH 5,0. </li><li> Cap os tubos Sarstedt e calor durante 20 min. a 80 ° C em um bloco de aquecimento. </li><li> Legal da suspensão sobre o gelo. </li><li> Adicionar os seguintes agentes para o pellet: 35 mL de 0,01% de azida de sódio (NaN3), 35 mL de amilase (50 mcg / mL H 2 O, a partir de espécies de Bacillus, Sigma); 17 pululanase mL (17,8 unidades de acidopullulyticus Bacillus; Sigma) . Tampe o tubo e vortex completamente. </li><li> A suspensão é incubado durante a noite a 37 ° C no shaker. Orientar os tubos na horizontal assessores melhorou mistura. </li><li> Suspensão de calor a 100 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento para terminar a digestão. </li><li> Centrifugação (10.000 rpm, 10 min) e descarte de amido contendo sobrenadante solubilizados. </li><li> Lave o pellet restantes três vezes pela adição de 1,5 ml de água, vortex, centrifugação, decantação e da água de lavagem. </li><li> Ressuspender pellet em 500 mL de acetona. </li><li> Evaporar o solvente com uma corrente de ar a 35 ° C até secar. Pode ser necessário também para quebrar o material no tubo com uma espátula para secar melhor. O material seco apresenta parede celular isolada (lignocelulose). Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento. </li></ol> 2. Teor de lignina Este método é baseado em um método relatado por Fukushima e Hatfield 3. <ol><li> Pesar 1-1,5 mg de material preparado da parede celular (ver 1) para balão volumétrico de 2 ml deixando um tubo vazio para um em branco. </li><li> lavar paredes do tubo com 250 mL de acetona para recolher o material da parede celular na parte inferior do tubo, e evaporar a acetona muito gentil com fluxo de ar. </li><li> Delicadamente adicionar 100 ml de solução de brometo de acetila acabado de fazer (25% v / v brometo de acetila em ácido acético glacial) ao longo das paredes do tubo para evitar respingos. </li><li> Cap balão e aquecer a 50 ° C por 2 horas </li><li> Calor por uma hora adicional com vórtex a cada 15 minutos. </li><li> Fresco no gelo à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 400 mL de hidróxido de sódio 2M e 70 mL de recém-preparados 0,5 M cloridrato de hidroxilamina. Vortex frascos volumétricos. </li><li> Encher o balão volumétrico exatamente à 2,0 ml marca com ácido acético glacial, tampa e inverter várias vezes para misturar. </li><li> Pipeta de 200 mL da solução para um UV 96 placa específica bem e lido em um leitor de ELISA em 280nm. </li><li> Determinar a porcentagem de lignina solúvel em brometo de acetila (ABSL%), utilizando um coeficiente adequado (Poplar = 18,21; Gramas = 17,75; Arabidopsis = 15,69) com a seguinte fórmula: % ABSL Calc: <img src="/files/ftp_upload/1745/1745eq.jpg" alt="Figura 1" /> Multiplicação de ABSL%, com 10 resultados na unidade de parede ug / mg de células Ele ajuda a fazer pelo menos 3 placa lê a média da absorbância (abs) desde partículas pode causar uma ligeira variação nos valores de absorbância. Nota: 0,539 centímetro representa a extensão de caminho, mas dependendo da placa esta pode ter de ser determinado. </li></ol> 3. Composição lignina Este método é adotado a partir de um método recente publicado por Robinson e Mansfield 5. <ol><li> Transferir aproximadamente 2 mg de material de parede celular (ver 1.) Em um tubo de vidro tampado para thioacidolysis parafuso. </li><li> preparar cuidadosamente a 2,5% de boro trifluoreto dietil etherate (BF 3), 10% etanotiol solução (EtSH). Você deve usar um balão cheio de gás nitrogênio para deslocar o volume perdido na garrafa dioxano com nitrogênio. Dioxano é muito perigoso, não tome amostras ou equipamento fora do capô. Volumes necessários para a preparação da solução por amostra: 175 mL dioxano, 20 EtSH mL, 5 mL BF 3. </li><li> Adicionar 200 mL de EtSH, BF 3, solução de dioxano para cada amostra. </li><li> Headspace Purge frasco com gás nitrogênio e tampa imediatamente. </li><li> Aquecer a 100 ° C por 4 horas com suave a cada hora de mistura. </li><li> Reação final de resfriamento em gelo por 5 minutos. </li><li> Adicionar 150 mL de bicarbonato de sódio 0.4M, vortex </li><li> Para o clean-up adicionar 1 ml de água e 0,5 ml de acetato de etila vórtice, e deixe fases distintas (acetato de etila na água superior, na parte inferior). </li><li> Transferência de 150 mL da camada de acetato de etila em um tubo de 2 ml Sarstedt. Certifique-se de falta de água é transferida. </li><li> Evaporar o solvente por um concentrador de ar. </li><li> Adicionar 200 mL de acetona e evaporar (repetir para um total de duas vezes remover o excesso de água). </li><li> Para a derivatização TMS adicionar 500 mL de acetato de etila, 20 l de piridina, e 100 l de N, O-bis (trimetilsilil) acetamida a cada tubo. </li><li> incubar por 2 horas a 25 ° C. </li><li> Transferência de 100 ul da reação em um frasco de GC / MS e adicione 100 ml de acetona. </li><li> Analisar as amostras por GC equipado com um espectrômetro de massa quadrupolar ou detector de ionização de chama. Uma coluna HP-Agilent 5MS está instalado (30 mm X 0,25 mm X 0,25 espessura de filme). O gradiente de temperatura a seguir é usado com um atraso de 30 min solvente e um caudal de 1,1 ml / min: segure inicial a 130 ° C por 3 min, uma rampa de 3 ° C / min até a 250 ° C e segure por 1 min; permitir equilíbrio com a temperatura inicial de 130 ° C. </li><li> Picos são identificados por tempos de retenção relativos usando tetracosano padrão interno (opcional) ou por íons de massa característica do espectro de 299 m / z, 269 m / z, e 239 monômeros m / z de S, G e H, respectivamente (ver fig. 2). A composição dos componentes da lignina é quantificado definindo a área do pico total para 100% </li></ol> 4. Resultados representante Um exemplo de uma análise de parede é apresentado na Figura 2. Neste caso, álamo-tronco (madeira) foi analisada por vários procedimentos descritos na seção de protocolo. Um exemplo de cromatograma da separação de lignina-componentes após thioacidolysis e TMS derivatização é mostrado. Claramente, a abundância relativa de siringil (S), guaiacil (G), e p-hidroxifenol (H) unidades pode ser determinada. O conteúdo de lignina solúvel em brometo de acetila é auto-explicativo, pode-se esperar valores entre 20-50% do peso seco da parede. Deve-se notar que o brometo de acetila não solubilizar todos os presentes de lignina na parede, e que o grau de solubilização pode variar dependendo do material. No entanto, este método é relativamente fácil de realizar e rápida e dá uma excelente aproximação do teor de lignina em um material lignocelulósico. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1:. Muros Visão geral de análise lignocelulósicos Cell (lignocelulose) são isolados a partir de material vegetal bruto seco. O material da parede é então ponderado em alíquotas e subdividida para os ensaios diversos. Material da parede é tratado com brometo de acetila ea lignina solubilizada quantificados por espectroscopia de UV. Para a determinação da composição de lignina, material de parede é submetido a thioacidolysis. Os compostos fenólicos solubilizados sofrer derivatização TMS e pode então ser separados e quantificados por GC-MS análise. Da composição do polissacarídeo da matriz e protocolo de conteúdo cristalino da celulose é discutido na Parte II 2. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2:. Fichas análise abrangente lignocelulósicos de madeira de álamo madeira de álamo (Populus tremoloides), foram submetidos aos protocolos descritos. Ligin composição; H p-hidroxifenil; G guaiacil; unidades S siringil.

<ol>
	<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+isolation+of+lignin+for+utilization+as+a+standard+to+determine+lignin+concentration+using+the+acetyl+bromide+spectrophotometric+method.">Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method.</a> J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Robinson, A. R., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+poplar+lignin+monomer+composition+by+a+streamlined+thioacidolysis+procedure+and+near-infrared+reflectance-based+prediction+modeling.">Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling.</a> Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endo-transglycosylases.">Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li></ol>

Os métodos descritos permitem uma rápida avaliação quantitativa do teor de lignina e composição da biomassa vegetal lignocelulósica. Usando o robô iWall cerca de 350 amostras podem ser moídos e dispensados ​​por dia. O rendimento dos vários métodos analíticos por pessoa varia. Utilizando os protocolos descritos aqui, 30 amostras podem ser processadas para teor de lignina, e 15 para a composição de lignina por dia. Devido à natureza quantitativa das culturas de matérias-primas de dados ideal, variedade ou genótipos pode ser avaliada em termos de sua aptidão para a produção de biocombustível.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hydroxylamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>255580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetyl Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>135968</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanethiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E3708</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borontrifluoride diethyl etherate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>15719</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>15241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dioxane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>296309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6890 GC/5975B MSD</td>
<td>(lignin composition)</td>
</tr>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part i: lignin

A necessidade de renováveis, neutra de carbono, e matérias-primas sustentáveis ​​para a indústria e sociedade tornou-se uma das questões mais prementes para o século 21. Este reacendeu o interesse no uso de produtos vegetais como matérias-primas industriais para a produção de combustíveis líquidos para transporte<sup&gt; 1</sup&gt; E outros produtos, como materiais biocomposite<sup&gt; 7</sup&gt;. Biomassa vegetal continua sendo uma das maiores reservas inexploradas do planeta<sup&gt; 4</sup&gt;. É principalmente composta de paredes celulares, que são compostos de polímeros ricos em energia, incluindo a celulose, hemicelulose diversas (polissacarídeos da matriz, a lignina e polifenol<sup&gt; 6</sup&gt; E, assim, às vezes chamado de lignocelulose. No entanto, as paredes celulares das plantas evoluíram para ser recalcitrantes à degradação como paredes oferecem resistência à tração para as células e as plantas inteiras, afastar os patógenos, e permitir que a água para ser transportado em toda a planta, no caso de árvores de até mais de 100 m acima nível do solo. Devido às várias funções de paredes, há uma imensa diversidade estrutural entre as paredes de diferentes espécies de plantas e tipos de células dentro de uma única planta<sup&gt; 4</sup&gt;. Assim, dependendo do que as espécies cultivadas, a variedade de culturas, ou tecido de planta é usada para uma biorefinaria, as etapas de processamento para a despolimerização de produtos químicos / enzimática processos e posterior fermentação dos açúcares diferentes para biocombustíveis líquidos precisam ser ajustados e otimizados. Este fato reforça a necessidade de uma caracterização completa de matérias-primas de biomassa vegetal. Aqui nós descrevemos uma metodologia abrangente de análise que permite a determinação da composição da lignocelulose e é passível de uma média a high-throughput análise. Nesta primeira parte vamos nos concentrar na análise da lignina de polifenóis (Figura 1). O método começa com a preparação do material da parede celular destarched. A lignocelulose resultantes são, então, dividir para determinar o seu teor de lignina por solubilização acetylbromide<sup&gt; 3</sup&gt;, E da composição de lignina sua em termos de sua siringil, unidades guaiacil e p-hidroxifenil<sup&gt; 5</sup&gt;. O protocolo para analisar os hidratos de carbono na biomassa lignocelulósica incluindo conteúdo de celulose e composição do polissacarídeo matriz é discutido na Parte II<sup&gt; 2</sup&gt;.

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

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