Name: comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part i: lignin
Uploaded: 2010-03-11T16:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin at JoVE.com

Мы благодарны Мэттью Роберт Уэзерхед за прекрасную техническую и Джон Ральф, Университет Висконсина за ценные советы, обсуждения и образцы древесины тополя. Эта работа финансировалась министерством энергетики США (DOE) Великий Биоэнергетика озер Научно-исследовательский центр (DOE BER Управление по науке DE-FC02-07ER64494) и химических наук, наук о Земле и биологических наук отдела Управления основной энергии наук, Управление по науке , Министерство энергетики США (награда нет. DE-FG02-91ER20021).

1. Изоляция клеточной стенки <ol><li> Grind примерно 60-70мг воздушного или сублимированные растительного сырья с 5,5 мм из нержавеющей стальных шариков в 2 мл Sarstedt винтовой крышкой трубки использованием iWall, измельчения и дозирования робота (30 с). Альтернативных не-робота низкой пропускной процедуры с использованием шаровой мельницы (retschmill) представлен в части II 2. </li><li> Добавить 1,5 мл 70% водного раствора этанола в землю обойтись материала, и вихрь тщательно. </li><li> Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 10 мин для осаждения спиртом нерастворимого остатка. </li><li> Аспирацию или переливать супернатант. </li><li> Добавить 1,5 мл хлороформ / метанол (1:1 об / об) решение остатков и тщательно встряхнуть трубку для ресуспендирования гранул. </li><li> Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 10 мин и аспирата или переливать супернатант. </li><li> Ресуспендируют осадок в 500 мкл ацетона. </li><li> Evaporate растворитель с потоком воздуха при 35 ° С до полного высыхания. При необходимости высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре до дальнейшей обработки. </li><li> Для начала удаления крахмала из образца ресуспендируют осадок в 1,5 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натрия рН 5,0. </li><li> Cap Sarstedt труб и огне в течение 20 мин. при 80 ° С в нагревательном блоке. </li><li> Прохладный подвески на льду. </li><li> Добавьте следующие агенты гранул: 35 мкл 0,01% азида натрия (NaN3), 35 мкл амилазы (50 мкг / мл H 2 O; из видов Bacillus, Sigma), 17 мкл pullulanase (17,8 единиц из Bacillus acidopullulyticus; Sigma) . Крышка трубки и вихревые тщательно. </li><li> Подвеска инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С в шейкере. Ориентируемся трубы горизонтально помощники улучшение перемешивания. </li><li> Тепло подвески при 100 ° С в течение 10 мин в нагревательный блок прекратить пищеварение. </li><li> Центрифуга (10.000 оборотов в минуту, 10 мин) и отбросить супернатант, содержащий солюбилизированного крахмала. </li><li> Вымойте оставшиеся гранулы в три раза, добавляя 1,5 мл воды, вортексе, центрифугирования, а перефасовки промывных вод. </li><li> Ресуспендируют осадок в 500 мкл ацетона. </li><li> Evaporate растворитель с потоком воздуха при 35 ° С до полного высыхания. Это может быть необходимо также, чтобы разбить материал в пробирке с помощью шпателя для лучшей сушки. Высушенный материал представляет изолированных клеточных стенок (lignocellulosics). При необходимости высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре до дальнейшей обработки. </li></ol> 2. Содержание лигнина Этот метод основан на методе сообщили по Фукусима и Хэтфилд 3. <ol><li> Взвесьте 1 - 1,5 мг подготовленный материал клеточной стенки (см. 1) в 2 мл мерную колбу, оставляя одну трубку пустой пустой. </li><li> промыть стенки трубы с 250 мкл ацетона собирать материал клеточной стенки в нижней части трубки, и испаряются ацетона очень нежный под потоком воздуха. </li><li> Аккуратно добавить 100 мкл свежеприготовленный раствор ацетил бромид (25% об. / ацетил метила в ледяной уксусной кислоты), вдоль стенок трубы для предотвращения разбрызгивания. </li><li> Cap мерную колбу и тепла при температуре 50 ° С в течение 2 часов </li><li> Тепло для дополнительного часа с вортексе каждые 15 минут. </li><li> Прохладный на лед до комнатной температуры. </li><li> Добавить 400 мкл 2М ​​гидроксида натрия и 70 мкл свежеприготовленного 0,5 М гидрохлорида гидроксиламина. Vortex мерные колбы. </li><li> Заполнение мерную колбу точно 2,0 мл знак ледяной уксусной кислотой, кепка и инвертировать в несколько раз перемешать. </li><li> Внесите 200 мкл раствора в УФ конкретных 96 ячейках и читать в ИФА на 280 нм. </li><li> Определить процент ацетил бромид растворимого лигнина (% ABSL) с использованием соответствующего коэффициента (Тополь = 18,21; Травы = 17,75; Arabidopsis = 15,69) со следующей формулой: % ABSL Calc: <img src="/files/ftp_upload/1745/1745eq.jpg" alt="Рисунок 1" /> Умножение% ABSL по 10 результатов в мкг / мг единицу клеточной стенки Это помогает сделать по крайней мере 3 пластины читает средний абсорбции (ABS), так как частицы могут вызвать небольшие изменения в значения абсорбции. Примечание: 0,539 см представляет длина пути, но в зависимости от пластины этого, возможно, потребуется определить. </li></ol> 3. Лигнин Состав Этот метод заимствован из последних метода опубликована Робинсон и Мэнсфилд 5. <ol><li> Передача около 2 мг клеточного материала стен (см. 1.) На винт ограничен стеклянной трубкой для thioacidolysis. </li><li> тщательно подготовить 2,5% трифторид бора диэтиловый эфирата (BF 3), 10% ethanethiol (EtSH) решение. Вы должны использовать шар, наполненный азотом для вытеснения потеряли объем в диоксане бутылку с азотом. Диоксан очень опасными, не брать пробы или оборудования из капота. Объемы, необходимые для приготовления раствора на образец: 175 мкл диоксана, 20 мкл EtSH; 5 мкл BF 3. </li><li> Добавить 200 мкл EtSH, BF 3, диоксан решение каждого образца. </li><li> Чистки флакон свободном пространстве с азотом и шапку немедленно. </li><li> Тепло при 100 ° С в течение 4 часов с нежным смешивания каждый час. </li><li> Конец реакции при охлаждении на льду в течение 5 минут. </li><li> Добавить 150 мкл 0,4 М раствором бикарбоната натрия, вихрь </li><li> Для очистки добавить 1 мл воды и 0,5 мл этилацетата, вихревые и пусть фазы отдельных (этилацетат сверху, вода на дно). </li><li> Передача 150 мкл Этилацетатный слой в 2 трубки мл Sarstedt. Убедитесь, что вода не передается. </li><li> Evaporate растворителя концентратор с воздухом. </li><li> Добавить 200 мкл ацетона и испаряются (повтор на общую сумму в два раза удалить лишнюю воду). </li><li> Для производных TMS добавить 500 мкл этилацетата, 20 мкл пиридина и 100 мкл N, O-бис (триметилсилил) ацетамида в каждую пробирку. </li><li> инкубировать в течение 2 часов при 25 ° C. </li><li> Передача 100 мкл реакции в ГХ / МС флакон и добавьте 100 мкл ацетона. </li><li> Анализ образцов GC оборудован квадрупольного масс-спектрометра или детектором ионизации пламени. Agilent HP-5MS колонка установлена ​​(30 мм х 0,25 мм х 0,25 мкм толщины пленки). Следующие градиента температуры используется с 30 мин растворитель задержки и 1,1 мл / мин расход: Начальная держать при температуре 130 ° С в течение 3 мин; 3 ° С / мин рампы 250 ° C и удерживайте в течение 1 мин; позволяют равновесия для начальной температуры 130 ° C. </li><li> Пики обозначены относительных времен удерживания использованием tetracosane внутреннего стандарта (опция) или характерный масс-спектре ионов 299 т / г, 269 м / г, и 239 т / г для S, G, H и мономеров, соответственно (см. рис. 2). Состав лигнина компоненты можно измерить с помощью установки общей площадью пика до 100% </li></ol> 4. Представитель Результаты Пример анализа стены представлена ​​на рисунке 2. В этом случае стволовые тополь (дерево) были проанализированы различные процедуры, изложенные в протоколе разделе. Пример хроматограммы разделения лигнина компонентов после thioacidolysis и ТМС-производных показана. Очевидно, что относительное обилие syringyl-(S), guaiacyl-(G), и р-hydroxyphenol-(H) единиц может быть определена. Содержание ацетил бромид растворимый лигнин говорит само за себя, можно ожидать, значения между 20-50% от сухого веса стены. Следует отметить, что ацетил бромид не растворить все лигнин присутствует в стену, и что степень растворения может изменяться в зависимости от материала. Однако этот метод является относительно легко осуществить и быстрым, и дает отличное приближение содержания лигнина в лигноцеллюлозных материала. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1:. Обзор лигноцеллюлозных анализ Клеточные стенки (lignocellulosics) выделяют из сырого высушенного материала растений. Материал стен, то взвешенный на аликвоты и подразделяется на различные анализы. Материал стен обрабатывают ацетил метила и растворяются лигнина количественно с помощью УФ-спектроскопии. Для определения состава лигнина, стеновой материал подвергается thioacidolysis. Солюбилизированного фенольные проходят ТМС производных и могут быть разделены и количественно с помощью ГХ-МС анализа. Состав матрицы полисахаридов и кристаллических протокол содержанием целлюлозы, обсуждается в Части II 2. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2:. Всеобъемлющее лигноцеллюлозных анализ древесины тополя Щепа от тополь (Populus tremoloides) были подвергнуты описаны протоколы. Ligin состава; Н р-гидроксифенил, G guaiacyl, S syringyl единиц.

<ol>
	<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+isolation+of+lignin+for+utilization+as+a+standard+to+determine+lignin+concentration+using+the+acetyl+bromide+spectrophotometric+method.">Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method.</a> J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Robinson, A. R., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+poplar+lignin+monomer+composition+by+a+streamlined+thioacidolysis+procedure+and+near-infrared+reflectance-based+prediction+modeling.">Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling.</a> Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endo-transglycosylases.">Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li></ol>

Описанные методы позволяют быстро количественной оценки содержания лигнина и состав лигноцеллюлозных биомассы растений. Использование робота iWall около 350 образцов могут быть отшлифованы и разливать в день. Пропускная способность различных аналитических методов на человека меняется. Использование протоколов, описанных здесь, 30 образцов могут быть обработаны для содержания лигнина и 15 для лигнина состава в день. Из-за количественного характера данных оптимальных культур сырья, разновидности или генотипов может быть оценен с точки зрения их пригодности для производства биотоплива.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hydroxylamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>255580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetyl Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>135968</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanethiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E3708</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borontrifluoride diethyl etherate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>15719</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>15241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dioxane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>296309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6890 GC/5975B MSD</td>
<td>(lignin composition)</td>
</tr>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part i: lignin

Необходимость возобновляемых, нейтральным уровнем эмиссии углерода и устойчивого сырья для промышленности и общества стала одной из самых актуальных вопросов для 21-го века. Это возродило интерес к использованию растительных продуктах, как промышленное сырье для производства жидкого топлива для транспорта<sup&gt; 1</sup&gt; И другие продукты, такие как биокомпозитного материалов<sup&gt; 7</sup&gt;. Растительной биомассы остается одним из самых больших неиспользованных резервов на планете<sup&gt; 4</sup&gt;. Она в основном состоит из клеточной стенки, которые состоят из богатых энергией полимеров, включая целлюлозу, различные гемицеллюлозы (матрицы полисахаридов и лигнина, полифенолы<sup&gt; 6</sup&gt; И, таким образом иногда называют lignocellulosics. Тем не менее, стен растительной клетки развились, чтобы быть непокорных к деградации и стены обеспечивают прочность на разрыв до клеток и целых растений, отвести патогенов, и позволяет воде, которые будут перевозиться по всему растению, а в случае деревьев до более 100 м над уровня земли. В связи с различными функциями стен, есть огромное структурное разнообразие в стенах различных видов растений и клеточных типов в пределах одного растения<sup&gt; 4</sup&gt;. Таким образом, в зависимости того, что видов сельскохозяйственных культур, урожай сорта или растительная ткань используется для переработке биологических веществ, обработки шаги для деполимеризации химическим / ферментативных процессов и последующего брожения различных сахаров в жидкое биотопливо необходимо скорректировать и оптимизировать. Этот факт лежит в основе необходимость тщательного характеристика сырья растительной биомассы. Здесь мы опишем всеобъемлющую аналитическую методологию, которая позволяет определить состав lignocellulosics и может принять от средней до высокой пропускной способностью анализа. В этой первой части мы сконцентрируемся на анализе полифенолов лигнина (рис. 1). Метод начинается не с подготовки destarched материал клеточной стенки. В результате lignocellulosics затем разделить, чтобы определить его содержание лигнина по acetylbromide солюбилизации<sup&gt; 3</sup&gt;, А его состав лигнина с точки зрения его syringyl, guaiacyl-и п-гидроксифенил единиц<sup&gt; 5</sup&gt;. Протокол для анализа углеводов в лигноцеллюлозных биомассы в том числе содержание целлюлозы и полисахаридов состав матрицы обсуждается в Части II<sup&gt; 2</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin at JoVE.com

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Растительной биомассы является одним из основных углеродно-нейтральным возобновляемым ресурсом, который может быть использован для производства биотоплива. Растительной биомассы в основном состоит из клеточных стенок, структурно-сложных композитных материалов называют lignocellulosics. Здесь мы опишем протокол для всестороннего анализа содержания и состава полифенольных лигнина.

Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть I: Лигнин

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть II: Углеводы

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Этикетка без На месте Изображений одревеснения в стенах растительной клетки

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...