Name: the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis
Uploaded: 2010-03-17T17:30:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis at JoVE.com

<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La struttura tridimensionale della cistatina complesso B (blu) con papaina (giallo). Mutato residui cistatina B sono mostrati in rosso. 1. Principi di Label-free Analisi interazione con i sistemi Biacore In un tipico esperimento senza etichetta vincolante con un sistema Biacore, una biomolecola chiamato il &#39;ligand&#39; è attaccato alla superficie di un chip del sensore. Un sistema di canali di flusso porta il suo partner di legame, chiamato il &#39;analita&#39;, a contatto con la superficie del chip, in cui la rilevazione si svolge. Quando l&#39;analita si lega al ligando, con conseguente cambiamento di accumulare massa in superficie è rilevata da risonanza plasmonica superficiale (SPR). La risposta SPR è proporzionale alla quantità di analita vincolanti. Dal momento che l&#39;associazione è misurata in tempo reale, la cinetica di associazione e dissociazione costanti di velocità per una specifica interazione può essere determinato. Da queste costanti, è possibile calcolare l&#39;affinità come la dissociazione costante di equilibrio. E &#39;anche possibile calcolare l&#39;affinità di dati allo steady-state vincolanti. Una metodologia simile può essere utilizzato anche per determinare la concentrazione di una proteina che si lega specificamente ad un ligando sulla superficie. 2. Analizzando le proprietà cinetiche di interazione proteina-proteina In X100 Biacore, analisi cinetiche possono essere eseguite utilizzando a ciclo unico cinetica. In un ciclo unico esperimento di cinetica, una serie concentrazione dell&#39;analita viene iniettato in un ciclo di analisi del singolo senza rigenerazione della superficie tra le iniezioni. Pertanto, a ciclo unico cinetica consente l&#39;analisi cinetica quando è difficile trovare le condizioni adatte rigenerazione. Una volta che i dati di un esperimento di cinetica è stato raccolto, il software X100 Biacore valutazione genera i valori di k A, K d e K D inserendo i dati in un modello di interazione. 3. Approcci per determinare la concentrazione delle proteine Analizzando le interazioni tra biomolecole è importante per capire la loro funzione. Che caratterizza il legame di proteine ​​ad altre proteine, di acidi nucleici, o di piccole molecole è fondamentale per la ricerca biochimica, e trova impiego in molti altri settori tra cui la scoperta di farmaci. Per la misurazione accurata della cinetica interazione tra due proteine ​​interagiscono, è essenziale conoscere la concentrazione di proteine ​​legame specifico nel campione sperimentale che viene utilizzato come analita. Una lettura spettrofotometro di A 280 o test colorimetrici come quella impiegando reagente di Bradford è comunemente usato per determinare la concentrazione di proteine ​​totali. Tuttavia, le impurità proteina può influenzare il risultato. Ancora più importante, entrambe le forme attive e inattive della proteina sono inclusi nella concentrazione di proteine ​​totali. In particolare nel caso di proteine ​​ricombinanti, che può essere inattivo a causa di piegatura errato, è importante per determinare la percentuale di proteine ​​legame specifico nel campione. In X100 Biacore, concentrazione relative a specifiche attività di legame può essere determinato dal confronto dei livelli di risposta legame con una curva di calibrazione derivato da uno standard conosciuto, o utilizzando la calibrazione-Free metodologia più recente introduzione Analisi Concentrazione (ACCP). ACCP non si basa su uno standard. Pertanto, ACCP è particolarmente utile nel caso di studiare forme mutanti di proteine, dove gli standard di solito non sono disponibili. In un esperimento ACCP, il tasso iniziale legame è misurata a diverse portate in condizioni in cui la diffusione di campione alla superficie del chip è rate-limiting. Il coefficiente di diffusione dell&#39;analita, le dimensioni della cella di flusso e le portate vengono presi in considerazione nel calcolo della concentrazione specifici vincolante dal 1,2 iniziale tasso vincolanti. In un esperimento cinetica, la concentrazione dell&#39;analita è utilizzato nel calcolo del tasso costante cinetica di associazione e l&#39;affinità dai dati sperimentali. ACCP e misurazione cinetica nei sistemi Biacore entrambi si basano sulle proprietà stessa interazione. Pertanto, usando la concentrazione specifico legame determinata da analisi Biacore, piuttosto che la concentrazione di proteine ​​totali, aumenta l&#39;affidabilità dei risultati. 4. Usando l&#39;analisi Biacore per caratterizzare l&#39;interazione tra la cistatina B e Papaina Cistatina B dei mammiferi è un inibitore reversibile, inibitore competitivo con le proteine ​​e tight-binding di papaina, come proteinasi cisteina, principalmente catepsina B, H, K, L e S. Queste proteine ​​sono principalmente coinvolti in NONSelettiva degradazione delle proteine ​​intracellulari. Cistatine si presume per proteggere le cellule ei tessuti da proteolisi inappropriate da questi enzimi. Hanno anche inattivare proteinasi cisteina da parassiti e virus e può partecipare alla difesa contro l&#39;invasione di questi agenti infettivi. Inoltre, cistatine inibire diversi cisteina proteinasi vegetali, come la papaina, che è spesso utilizzata come un enzima modello di struttura-funzione studi. La struttura tridimensionale del complesso cistatina B con papaina 3 mostra che l&#39;interazione tra le due proteine ​​è dominato da contatti idrofobiche, che, dal lato inibitori, sono forniti da N-e C-terminale e due anse a gomito ( Figura 1). In questo studio, si esamina l&#39;importanza del C-terminale e il secondo ciclo legame di cistatina B per il legame alla papaina utilizzando bovina cistatina B varianti contenenti mutazioni puntiformi nelle aree di interazione con papaina. Per prima cosa determinare la concentrazione specifico legame delle quattro varianti di cistatina B utilizzati, così come quella della proteina wild-type. Una volta che le concentrazioni specifico legame di cistatina B attivi sono determinati, le costanti di velocità e l&#39;affinità di tipo selvatico e varianti mutanti della cistatina B legame con la papaina sono misurati utilizzando X100 Biacore. 5. Strumenti e reagenti <ol><li> Le varianti cistatina B Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala e Cys3Ser sono prodotti come descritto in precedenza 4. Tutti i mutanti contengono una sostituzione aggiuntiva di cisteina a serina in posizione 3, per evitare la formazione di disolfuro-linked dimeri inattivi di cistatina B. </li><li> L&#39;obiettivo papaina è anche preparato come descritto in precedenza 5. Si tratta di S-(metiltio) papaina (MMTS-papaina) con un gruppo collegato al metiltio Cys25 nella fessura attiva, rendendo il proteasi cataliticamente inattiva. </li><li> X100 Biacore con X100 Biacore Package Plus è usato per misurare e analizzare le concentrazioni specifiche vincolanti e cinetica vincolanti. </li><li> MMTS-papaina è immobilizzato su CM5 Chip sensore utilizzando Biacore Kit di accoppiamento Amine. </li><li> Le piste sono eseguite a 25 ° C, e il buffer è di 0,01 Hepes M a pH 7,4, 0,15 M di NaCl, 0,0034 M EDTA, e 0,05% polisorbato 20. </li><li> Tra ogni variante di cistatina B, la superficie del sensore è rigenerato con 20 mM NaOH per 30 secondi ad una portata di 10 L / min. </li></ol> 6.Immobilization del Ligand MMTS-papaina Attacco covalente di MMTS-papaina per ACCP analisi ACCP si basa sulla misurazione del tasso di legame in condizioni in cui è limitato il tasso di diffusione delle molecole di analita alla superficie (limitazione di trasporto di massa). Ciò è favorito da livelli elevati di immobilizzazione del ligando. Immobilizzazione di MMTS-papaina è stata creata ed eseguire utilizzando la procedura guidata immobilizzazione del software di controllo X100 Biacore. <ol><li> Attivare la superficie in cella di flusso 2 per l&#39;iniezione di una miscela di succinimide (NHS) e carbodiimmide (EDC) per 7 minuti ad un flusso di 10 L / min. Cella di flusso 1 è lasciato invariato al fine di essere usato come superficie di riferimento. </li><li> Iniettare MMTS-papaina a 50μg/ml in tampone sodio acetato a pH 4,5 per 15 minuti ad un flusso di 5 microlitri / min. </li><li> Etanolammina viene iniettato per 7 minuti ad un flusso di 10 L / min per disattivare rimanenti esteri attivi. </li></ol> La procedura di accoppiamento tutto dovrebbe tradursi in ~ 3000 RU MMTS-papaina immobilizzato nella cella di flusso 2. Attacco covalente di MMTS-papaina per l&#39;analisi cinetica La stessa procedura viene utilizzata per immobilizzare MMTS-papaina per l&#39;analisi cinetica, con la sola differenza che in analisi cinetica, il livello di immobilizzazione deve essere basso per evitare il tasso di diventare vincolante limitata per diffusione. Cella di flusso 1 è lasciato non modificato in questa fase anche per essere usato come superficie di riferimento. <ol start="4"><li> Dopo l&#39;attivazione della superficie con la miscela di NHS e EDC come in 7.1, MMTS-papaina è iniettato a 1μg/ml per 50 secondi. Dopo che la superficie viene disattivato con un&#39;iniezione di etanolamina come al punto 7.3. </li></ol> Il livello di accoppiamento deve essere di circa il 50 RU dopo questa procedura. 7. Concentrazione di cistatina B Determinazione del saggio di ACCP <ol><li> L&#39;esperimento ACCP è impostato secondo la procedura guidata ACCP in Biacore X100 Plus Package. Circa 10 nM proteina viene iniettata a portate 10 e 100 l / min in duplice copia per 48 secondi. La superficie è rigenerato con 20 mM di NaOH tra ogni ciclo. </li><li> Comprendono le iniezioni in bianco per ogni portata. </li><li> La concentrazione di proteina è quindi determinato dalla associazione dei dati (Figura 3) utilizzando °e ACCP caratteristica valutazione dei X100 Biacore Inoltre la valutazione del software pacchetto. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. I risultati dell&#39;analisi ACCP di wild-type cistatina B. I dati specifici concentrazione vincolanti è stato estratto dal sensorgrams ottenuto a portate di 10 e 100 l / min. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Concentrazioni Figura 3. Dei mutanti determinato utilizzando A 280 misurazioni (n = 3) e ACCP (n = 2). Gli errori standard sono indicati da barre di errore. I coefficienti di assorbimento molare sono stati calcolati come descritto in (6). Una grande differenza nei valori di concentrazione Cys3Ser/Leu73Gly mutante determinato con i due metodi possono essere osservati. </li><li> Se si confronta la concentrazione determinata da una misura 280 con quella da ACCP, è chiaro che, mentre nella maggior parte dei casi la proteina è pienamente attiva, per la variante Cys3Ser/Leu73Gly, la frazione di proteina attiva è molto basso (Figura 3). La tabella qui sotto mostra le attività della cistatina B varianti legate alla concentrazione totale da A 280. <table border="0"><tbody><tr><td> Campione </td><td> ACCP rispetto ad A 280 (%) </td></tr><tr><td> Tipo selvatico </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. Misurazione della Cinetica di cistatina B legame Papaina <ol><li> Sulla base delle misurazioni ACCP, preparare una duplice serie di concentrazione da 2,5 a 40 Nm per ciascuna delle varianti della cistatina B. </li><li> L&#39;esperimento cinetica viene configurato tramite la procedura guidata cinetica in X100 Biacore con l&#39;approccio singolo ciclo. La superficie non viene rigenerato tra iniezioni, ma dopo la fine di ogni ciclo di analisi utilizzando 20 mM NaOH come soluzione di rigenerazione. </li><li> Impostare l&#39;esperimento in modo che ogni ciclo che contiene campione è affiancata da un ciclo di vuoto, dove viene iniettato buffer invece di campione. </li><li> Utilizzare la funzione di valutazione cinetica in X100 Biacore per eseguire automaticamente sottrazioni vuoto di riferimento sottratto i dati prima di montare un modello di interazione 1:1. </li><li> I dati sperimentali ottenuti per il legame di varianti cistatina B di papaina è mostrata in Figura 4. La tabella seguente riassume l&#39;associazione e costanti di velocità di dissociazione e la costante di equilibrio di dissociazione ottenuti nelle analisi cinetica. <table border="0"><tbody><tr><td> Campione </td><td> k un (M -1 s -1) </td><td> k d (s -1) </td><td> K D (M) </td></tr><tr><td> Tipo selvatico </td><td> 1,8 x 10 6 </td><td> 0,41 x 10 -3 </td><td> 2,3 x 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 1,7 x 10 -3 </td><td> 1,5 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 23 x 10 -3 </td><td> 2,2 x 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1,7 x 10 6 </td><td> 12 x 10 -3 </td><td> 7,1 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0.9 x 10 6 </td><td> 0,53 x 10 -3 </td><td> 5,8 x 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Profili cinetici per le varianti B cistatina legame MMTS-papaina determinato utilizzando cinetica singolo ciclo. Sensorgrams spettacolo vuoto e di riferimento sottratto dati con fit cinetici per 1:1 modello di interazione sovrapposti in nero. </li><li> Mentre i tassi di associazione dei mutanti sono paragonabili a quella della proteina wild-type (Figura 5, pannello superiore), le costanti di velocità di dissociazione dei mutanti può essere superiore di quasi due ordini di grandezza, con un corrispondente aumento l&#39;equilibrio di dissociazione costante (Figura 5, riquadro inferiore). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. I calcoli delle costanti di velocità e l&#39;affinità sono stati basati sulle concentrazioni ottenute da ACCP. I cambiamenti di k A, K d e K D, associato con le mutazioni sono rappresentati nei grafici. </li><li> Dal momento che la concentrazione del campione è un parametro per il calcolo del tasso di associazione costante dai dati sperimentali, èimportante che sia corretta. Utilizzando la concentrazione in base alla misura A 280 invece di CFCA porterebbe alla conclusione che Leu73 è importante per il tasso di associazione, in cui la sostituzione sembra tradursi in circa 10 volte più lento di associazione altre varianti cistatina B. Tuttavia, la concentrazione specifico legame misurata ACCP è solo il 10% delle proteine ​​totali, in questo caso. Quando questo viene preso in considerazione questo diventa chiaro che il tasso di associazione per Leu73 è simile a quella della altre varianti. Pertanto, ACCP permette una corretta valutazione di k a e K D rendendo così possibile l&#39;interpretazione appropriata del meccanismo di interazione. </li></ol>

<ol>
	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

L&#39;autore è un dipendente di GE Healthcare che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

In questo lavoro, quattro mutanti e selvaggia cistatina B tipo sono stati prodotti al fine di valutare l&#39;importanza del secondo ciclo vincolante e C-terminale per l&#39;interazione tra cistatina B e la papaina. Questo studio ha dimostrato il vantaggio e la facilità di utilizzo X100 Biacore per determinare la concentrazione vincolanti e specifici per analizzare la cinetica di interazioni proteina-proteina al fine di comprendere le relazioni tra struttura e funzione. Abbiamo dimostrato che misura la concentrazione totale di proteine ​​non rivela le varianti proteiche che hanno ridotto l&#39;attività vincolante, che in questo caso introduce un errore significativo di misura nella determinazione di affinità di legame e cinetica. Le concentrazioni specifico legame delle varianti della cistatina B sono stati determinati utilizzando ACCP con X100 Biacore. Mediante misure di concentrazione di ACCP come input per l&#39;analisi cinetica portato a tasso affidabili e costanti di affinità, permettendo così la giusta interpretazione del meccanismo di interazione. Le affinità diminuzione dei mutanti erano quasi esclusivamente a causa di un maggiore K D-value, mentre k uno è stato colpito solo leggermente. Questo comportamento indica che sia la seconda regione ciclo vincolante e il C-terminale non sono importanti per il tasso di legame inibitore alla papaina. Al contrario, contribuiscono ad affinità di legame soprattutto mantenendo l&#39;inibitore attaccato al enzima una volta che il complesso è stato formato.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

In questo studio, esploriamo l&#39;interazione tra il bovino B inibitore della proteasi cistatina cisteina e una forma cataliticamente inattiva di papaina (Fig. 1), una proteasi cisteina stabilimento, da un&#39;analisi in tempo reale senza etichetta con X100 Biacore. Diverse varianti di cistatina B con mutazioni puntiformi nelle aree di interazione con la papaina, vengono prodotti. Per ogni variante di cistatina B si determina la concentrazione specifico legame con la calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) e confrontare i valori ottenuti con la concentrazione di proteine ​​totali, come determinato da A<sub&gt; 280</sub&gt;. Dopo di che, la cinetica di ogni variante B cistatina legame con la papaina è misurata utilizzando a ciclo unico cinetica (SCK). Abbiamo dimostrato che una delle quattro varianti di cistatina B prendiamo in esame è solo parzialmente attivo per il legame. Questa attività parziale, rivelato da ACCP, si traduce in una differenza significativa nel tasso di associazione costante (<em&gt; K</em<sub&gt; Un</sub&gt;) E di affinità (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), Rispetto ai valori calcolati utilizzando concentrazione totale delle proteine. ACCP utilizzando in combinazione con l&#39;analisi cinetica in una struttura-funzione di studio contribuisce ad ottenere risultati affidabili, e contribuisce a rendere la giusta interpretazione del meccanismo di interazione.

Watch this Scientific Journal Video about The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis at JoVE.com

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Noi applichiamo un&#39;etichetta priva di analisi di interazioni proteina utilizzando X100 Biacore per la struttura-funzione di analisi del legame di mutanti diversi cistatina B di papaina attraverso la caratterizzazione cinetica. Calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) misura la concentrazione di proteine ​​con attività di legame mantenuto senza la necessità di una curva standard. Abbiamo dimostrato che la conferma delle concentrazioni utilizzando ACCP aumenta l&#39;affidabilità delle analisi cinetica e che le costanti cinetiche possono essere affidabile anche se l&#39;attività di una proteina ricombinante è ridotta.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Ricerca

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...