Name: an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species at JoVE.com

We willen graag de volgende personen, zonder wiens hulp het verzamelen van dennen weefsels zou niet mogelijk zijn geweest bedanken: Dr Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, en Amanda Bouffier.

Deel 1: Boom Harvest Nadat de boom is geselecteerd en gekapt, is het belangrijk om te werken als zorgvuldig en zo snel mogelijk. Aangezien elke ander weefseltype wordt geoogst, moeten ze onmiddellijk worden geplaatst in hun eigen vloeibare stikstof vaartuigen om elke kruisbesmetting van het monster materiaal te voorkomen. Deze RNA-isolatie protocol is schaalbaar. <ol><li> Snijd bouten in lengten van ca. 0,5-0,75 m en met een kettingzaag de schors score in twee of drie plaatsen naa...

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

Het verkrijgen van hoge kwaliteit RNA uit naaldbomen, kan een moeilijke taak, gezien de hoge niveaus van fenol-en polysaccharide verbindingen aangetroffen in bosrijke weefsels. Te beginnen met het protocol ontwikkeld door Chang et al.. (1), hebben we ontdekt dat een strengere extractie en clean-up treden leiden naar de consistente isolatie van zeer hoge kwaliteit totaal RNA uit diverse houtige en niet-houtige weefsels bemonsterd uit een breed scala van naaldbomen. Deze video heeft aangetoond dat niet alleen onze gewijzi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

Weefsels geïsoleerd van naaldbomen, in het bijzonder die welke behoren tot de Pinaceae familie, zoals loblolly den (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), bevatten hoge concentraties van fenolische verbindingen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Isolatie van hoge kwaliteit RNA van deze soorten vergt rigoureuze weefsel verzameling procedures op het gebied en de inzet van een RNA-isolatie protocol bestaat uit meerdere organische extractie stappen om RNA van voldoende kwaliteit te isoleren voor microarray en andere genomische analyses. De isolatie van hoge kwaliteit RNA uit het veld verzameld loblolly pine monsters kan lastig zijn, maar een aantal aanpassingen aan standaard-weefsel en RNA-isolatie procedures sterk verbeteren resultaten. De omvang van het algemeen RNA degradatie verhoogt, indien monsters die niet goed zijn verzameld en vervoerd van het veld, met name tijdens grootschalige oogsten. Totaal RNA opbrengst kan aanzienlijk worden verhoogd door verpulveren monsters in een vloeibare stikstof vriezer molen voorafgaand aan de isolatie RNA, vooral wanneer monsters komen uit houtachtige weefsels. Dit is vooral te danken aan de aanwezigheid van oxiderende stoffen, zoals fenolische verbindingen, en polysacchariden die zowel aanwezig zijn op een hoog niveau in uittreksels uit de houtachtige weefsels van de meeste naaldbomen. Indien niet verwijderd, kan deze verontreinigingen overdracht leidt tot problemen, zoals RNA degradatie, die resulteren in lage opbrengsten en een slechte kwaliteit RNA monster. Overdracht van fenolische verbindingen, evenals polysacchariden, kan ook verminderen of zelfs volledig te elimineren de werking van reverse transcriptase of andere polymerasen gebruikt voor cDNA synthese. In het bijzonder RNA bestemd om te worden gebruikt als sjabloon voor double-stranded cDNA synthese in het genereren van cDNA-bibliotheken, enkelstrengs cDNA synthese voor PCR of qPCR, of voor de synthese van microarray doel materialen moeten van de hoogste kwaliteit als onderzoekers verwachten beste resultaten te verkrijgen. RNA-isolatie technieken die gewoonlijk gebruikt voor vele andere plantensoorten zijn vaak onvoldoende in hun vermogen om deze verontreinigingen te verwijderen van de coniferen monsters en dus geen opbrengst totaal RNA monsters geschikt zijn voor downstream-manipulaties. In deze video tonen we methoden voor het gebied collectie coniferen weefsels, te beginnen met het kappen van een veertig jaar oude boom, op het verzamelen van floëem, secundaire xyleem, en reactie hout xyleem. We tonen ook aan een RNA-isolatie protocol dat consequent heeft opgeleverd van hoge kwaliteit RNA voor latere enzymatische manipulaties.

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species at JoVE.com

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Veel planten-weefsels, waaronder floëem en xyleem van loblolly den (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), bevatten een hoog niveau van fenolen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Deze presentatie behandelt technieken voor de oogst van het veld geteelde weefsels en isolatie van RNA van voldoende kwaliteit zijn voor microarrays en andere genomische analyses.

Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybride-Cut: een verbeterde Sectioning Methode voor Recalcitrante plantenweefsel Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...