Name: studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

1) إعداد مفترق ذبابة الفاكهة السوداء البطن العضلية العصبية (NMJ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معيار ذبابة الفاكهة ملحي (كلوريد الصوديوم 130 ملم ، 36 ملم السكروز ، 5 ملي بوكل ، CaCl 2 مم 2 ، 2 مم MgCl 2 ، 5 ملي Hepes ، ودرجة الحموضة 7.3 4. </l...

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

وينبغي اتخاذ بعض الخطوات الهامة في الاعتبار : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يقوم على حضانة DAB إلا بعد الغسل الكامل والتبريد من الاستعدادات. وإلا فإن رد فعل غير غلوتارالدهيد التفاعل مع وتسبب هطول الأمطار DAB والخمسين (عادة على شكل بلورات ال?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

اندماج الحويصلات متشابك مع غشاء البلازما (إيماس) هو خطوة لازمة في الافراج عن العصبي والاتصالات العصبية. ثم يتم استرداد الحويصلات من غشاء البلازما (الإلتقام) ويتم تجميعها معا مع التجمع العام للحويصلات داخل محطة العصبية ، حتى الخضوع لEXO ودورة جديدة الإلتقام (تدوير الحويصلة). وقد درست هذه العمليات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات مثل المجهر الإلكتروني والتسجيلات الكهربية وamperometry وقياسات السعة. الأهم من ذلك ، خلال العقدين الماضيين ظهر عدد من علامات fluorescently المسمى ، والسماح لتتبع تقنيات بصرية الحويصلات في الديناميات الخاصة بإعادة التدوير. واحدة من العلامات الأكثر شيوعا هي styryl FM أو صبغة 1 ؛ هيكليا ، وكلها تحتوي على الأصباغ وزير الخارجية رئيس ماء وذيل محبة للدهون متصلا من خلال حلقة العطرية واحد أو أكثر من السندات المزدوجة (الشكل 1B). وصبغ التجربة الكلاسيكية وزير الخارجية لتسمية مجموعة من الحويصلات تتمثل في إعداد الاستحمام (الشكل 1Ai) مع الصبغة خلال تحفيز العصب (كهربائيا أو مع ارتفاع K +). هذا يؤدي الى إعادة تدوير حويصلة وتحميل اللاحقة للصباغة في الحويصلات endocytosed مؤخرا (الشكل 1A I - III). وبعد تحميل الحويصلات مع صباغة ، جولة ثانية من التحفيز في حمام صبغة خالية تؤدي الى الافراج عن وزير الخارجية خلال إيماس (الشكل 1A IV - V) ، والعملية التي يمكن اتباعها من خلال رصد انخفاض كثافة مضان (destaining). على الرغم من الأصباغ وزير الخارجية قد ساهمت إلى حد كبير في مجال إعادة التدوير الحويصلة ، فإنه ليس من الممكن تحديد الدقيق أو توطين مورفولوجية حويصلات الفردية باستخدام المجهر مضان التقليدية. لهذا السبب ، نحن هنا شرح كيفية FM الأصباغ ويمكن أيضا أن تستخدم كعلامات التقامي باستخدام المجهر الإلكتروني ، من خلال photoconversion. تقنية photoconversion يستغل ممتلكات الأصباغ الفلورية لتوليد أنواع الاكسجين التفاعلية تحت الإضاءة الشديدة. وغرقت الاستعدادات fluorescently المسمى في محلول يحتوي على diaminobenzidine (DAB) ومضيئة. رد الفعل الأنواع التي تم إنشاؤها بواسطة جزيئات صبغة أكسدة DAB ، الذي يشكل مستقرة ، غير قابلة للذوبان تترسب يحتوي على المظهر المظلم الذي يبدو ويمكن تمييزها بسهولة في المجهر الإلكترون 2،3. كما يتأكسد DAB فقط في الجوار المباشر للجزيئات فلوري (كما في أنواع الاكسجين التفاعلية قصيرة الأجل) ، وتقنية تضمن هياكل fluorescently فقط المسمى ذاهبون لاحتواء يعجل الإلكترونات كثيفة. هذه التقنية تسمح بذلك دراسة مورفولوجية والمكان المحدد لإعادة تدوير بنشاط العضيات.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

وقد الأصباغ وزير الخارجية للمساعدة لا تقدر بثمن في فهم ديناميات متشابك. ويتبع عادة وزراء خارجية تحت المجهر الفلورسنت خلال ظروف مختلفة التحفيز. ومع ذلك ، photoconversion من الأصباغ وزير الخارجية جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني يسمح التصور من حمامات متميزة حويصلة متشابك ، الترآيب الدقيق بين مكونات أخرى ، وحبات متشابك.

دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

مقايسة ضوئية لإعادة التدوير حويصلة متشابك في الخلايا العصبية مثقف Overexpressing البروتينات Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...