Name: studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

1) Bereiding van Drosophila melanogaster neuronale gespierd splitsing (NMJ) <ol><li> Bereid standaard Drosophila zoutoplossing (130 mM NaCl, 36 mM sucrose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Ontleden de bereiding in een zoutoplossing (1.1). De Drosophila larven is dorsale zijde-up kwijnde in een Sylgard schotel; de dorsale zijde is ingedeeld lengte, en de inwendige organen worden verwijderd. Het preparaat wordt dan uitgerekt en kwijnde. Meerder...

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

Een paar kritische stappen moet rekening worden gehouden met: <ul><li> De DAB incubatie mag alleen worden uitgevoerd na een grondig wassen en afschrikken van de voorbereidingen. Anders wordt de niet-gereageerde glutaaraldehyde zal interageren met DAB en de oorzaak zijn neerslag (meestal in de vorm van platte kristallen, die niet elektron dicht). De voorbereidingen waar dit gebeurt neerslag overvloedig zijn zelden bruikbaar zijn voor elektronenmicroscopie. </li><li> Verlichting tijden moet worden geoptimaliseerd, doo...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

De fusie van synaptische blaasjes met de plasmamembraan (exocytose) is een vereiste stap in de neurotransmitters en neuronale communicatie. De blaasjes worden vervolgens opgehaald uit de plasmamembraan (endocytose) en samengevoegd met de algemene pool van blaasjes in het zenuwuiteinde, totdat ze ondergaan een nieuwe exo-en endocytose cyclus (blaasjes recycling). Deze processen zijn bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan technieken zoals elektronen microscopie, elektrofysiologie opnames, amperometrie en capaciteit metingen. Belangrijk is dat gedurende de laatste twee decennia een aantal van de fluorescent gelabelde markers ontstaan, waardoor optische technieken om blaasjes track in hun recycling dynamiek. Een van de meest gebruikte markers is de styrylkleurstoffen of de FM-kleurstof 1, structureel, alle FM-kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een staart van lipofiele aangesloten via een aromatische ring en een of meer dubbele bindingen (Fig. 1B). Een klassieke FM kleurstof experiment om een pool van blaasjes label bestaat uit het wassen van de voorbereiding (Fig. 1Ai) met de kleurstof tijdens de stimulatie van de zenuw (elektrisch of met een hoge K +). Dit leidt tot blaasje recycling en de daaropvolgende laden van de kleurstof in recent endocytosed blaasjes (afb. 1A i-iii). Na het laden van de blaasjes met kleurstof, een tweede ronde van de stimulatie in een dye-vrij bad zou leiden tot de FM-versie door middel van exocytose (afb. 1A IV-V), proces dat kan worden gevolgd door het toezicht op de fluorescentie-intensiteit afnemen (ontkleuren). Hoewel de FM kleurstoffen hebben sterk bijgedragen aan het gebied van recycling blaasje, is het niet mogelijk om de exacte lokalisatie of de morfologie van de individuele blaasjes te bepalen door gebruik te maken van conventionele fluorescentie microscopie. Om die reden leggen we uit hier hoe FM kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt als endocytische markers met behulp van elektronenmicroscopie, door middel van photoconversion. De photoconversion techniek maakt gebruik van het eigendom van fluorescente kleurstoffen aan reactive oxygen species te genereren onder intense verlichting. Fluorescent gelabelde bereidingen worden ondergedompeld in een oplossing die diaminobenzidine (DAB) en verlicht. Reactieve stoffen die door de kleurstof moleculen oxideren van de DAB, die een stabiele, onoplosbaar precipitaat dat een donkere verschijning heeft en kan gemakkelijk worden onderscheiden in elektronenmicroscopie 2,3 vormen. Omdat DAB is alleen geoxideerd in de directe omgeving van fluorescerende moleculen (zoals de reactieve zuurstof species zijn van korte duur), de techniek zorgt ervoor dat alleen fluorescent gelabelde structuren gaan de elektron-dense neerslag bevatten. De techniek laat dus de studie van de exacte locatie en de morfologie van actief recycling organellen.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

FM kleurstoffen zijn van onschatbare hulp bij het begrijpen van synaptische dynamiek. FMS worden normaal gevolgd onder de fluorescentie microscoop tijdens de verschillende stimulatie omstandigheden. Echter, photoconversion van de FM-kleurstoffen in combinatie met elektronenmicroscopie kan de visualisatie van verschillende synaptische vesicles zwembaden, onder andere ultrastructuur componenten, in de synaptische boutons.

Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Voorbereiding en Techniek for Performing Patch Clamp Recordings van Submitochondrial Vesicle Membranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...