Name: studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

1) Подготовка дрозофилы нейронов мышечного соединения (NMJ) <ol><li> Подготовка стандартных дрозофилы физиологическим раствором (130 мМ NaCl, 36 мМ сахарозы, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2, 5 мМ HEPES, рН 7,3 4. </li><li> Рассеките подготовки в физиологическом растворе (1.1). Личинки дрозофилы ?...

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

Несколько важных шагов должно быть принято во внимание: <ul><li> Инкубационный DAB следует проводить только после тщательного промывания и тушения препаратов. В противном случае, не реагировал глутаральдегида будут взаимодействовать с DAB и вызывают ее осадков (как правило, в виде плоских...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

Слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной (экзоцитоз) является необходимым шагом в выпуске нейромедиатора и нейронные связи. Пузырьки затем выбираться из плазматической мембраны (эндоцитоз) и группируются вместе с общим бассейном пузырьков внутри нервного окончания, пока они не проходят новые экзо-и эндоцитоза цикла (пузырька утилизации). Эти процессы были изучены с использованием различных методов, таких как электронная микроскопия, электрофизиологии записей, amperometry и измерения емкости. Важно отметить, что в течение последних двух десятилетий число флуоресцентно меченых маркеров появились, позволяя оптические методы для отслеживания пузырьков в их динамике утилизации. Один из наиболее часто используемых маркеров стирил или FM красителя 1; структурно, все FM красители содержат гидрофильные головы и липофильный хвост подключен через кольцо ароматических и одну или несколько двойных связей (рис. 1В). Классическая FM эксперимент красителя для маркировки пул везикул состоит в ванной подготовки (рис. 1Ai) с красителем при стимуляции нерва (электрически или с высоким K +). Это вызывает переработки пузырек и последующие загрузки красителя в недавно эндоцитарных пузырьки (рис. 1А I-III). После загрузки пузырьки с красителем, второй раунд стимуляции в краситель без ванны вызовет FM-релиз через экзоцитоза (рис. 1А IV-V), процесс, который может сопровождаться мониторинга флуоресценции снижение интенсивности (destaining). Хотя FM красителей внесли большой вклад в области переработки пузырьков, это не представляется возможным определить точную локализацию и морфологии отдельных пузырьков с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. По этой причине мы объясняем здесь, как FM-красители могут также быть использованы в качестве маркеров endocytic с помощью электронной микроскопии, через фотопреобразования. Фотопреобразования техника использует свойства флуоресцентных красителей для генерации активных форм кислорода при интенсивном освещении. Флуоресцентно меченных препаратов погружен в раствор, содержащий диаминобензидина (DAB) и освещены. Активные формы порожденные молекулы красителя окисляется DAB, который образует стабильный, нерастворимый осадок, который имеет темно внешнему виду и можно легко отличить в электронной микроскопии 2,3. Как DAB только окисляется в непосредственной близости от флуоресцентных молекул (как активных форм кислорода недолговечны), техника гарантирует, что только флуоресцентно меченных структуры будет содержать электронно-плотного осадка. Технику таким образом, позволяет изучение точное местоположение и морфология активно переработки органелл.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

FM красители имели неоценимую помощь в понимании синаптических динамики. Главы МИД, как правило, следуют под флуоресцентного микроскопа при различных условиях стимуляции. Тем не менее, фотопревращения FM красителей в сочетании с электронной микроскопии позволяет визуализации различных синаптических пузырьков бассейнов, среди других компонентов ультраструктура, в синаптических boutons.

Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; АТФазы Подготовка пузырька и техника исполнительских патч зажим Записи субмитохондриальных мембран везикул

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Экспертиза синаптических пузырьков переработка Использование FM Красители Во вызвали, спонтанный, и миниатюрных Synaptic деятельности

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Измеряя эндоцитоза синаптических пузырьков в культивированный Нейроны гиппокампа

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Сочетание Оптогенетика с искусственных микроРНК охарактеризовать последствия нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Оптических Assay для синаптических пузырьков рециркуляции в культивированный нейронов, экспрессирующих Пресинаптический белки

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...