Name: studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

1) Beredning av Drosophila melanogaster neuronal muskulär trafikplats (NMJ) <ol><li> Förbered standard Drosophila saltlösning (130 mM NaCl, 36 mM sackaros, 5 mm KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mm MgCl 2, 5 mm Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Dissekera beredningen i saltlösning (1,1). Den Drosophila Larverna är trånade ryggsidan upp i en Sylgard maträtt, ryggsidan är uppställd längsgående, och de inre organen tas bort. Preparatet är sedan sträcks och trånade. Flera ventrala muskler...

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

Några viktiga åtgärder som bör beaktas: <ul><li> DAB inkubation ska endast ske efter noggrann tvätt och härdning av förberedelserna. Annars icke-reagerade glutaraldehyd kommer att interagera med DAB och orsaka dess nederbörd (vanligtvis i form av platta kristaller, som inte är elektron tätt). Förberedelserna där denna utfällning sker i överflöd är sällan användbara för elektronmikroskop. </li><li> Belysning gånger bör optimeras, genom att testa flera identiska preparat med olika belysning tider....

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

Sammansmältningen av synaptiska vesiklar med plasmamembranet (exocytos) är ett obligatoriskt steg i signalsubstansen release och neuronal kommunikation. Den blåsor därefter hämtas från plasmamembranet (endocytos) och grupperas tillsammans med den allmänna pool av blåsor i nervändsluten, tills de genomgå en ny exo-och endocytos cykel (vesikler återvinning). Dessa processer har studerats med hjälp av olika tekniker såsom elektronmikroskopi, elektrofysiologi inspelningar amperometry och mätningar kapacitans. Viktigt under de senaste två decennierna ett antal fluorescerande markörer fram, vilket gör att optiska metoder för att spåra blåsor i deras återvinning dynamik. En av de mest använda markörerna är styryl eller FM-färg 1, strukturellt, alla FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofil svans ansluten via en aromatisk ring och en eller flera dubbelbindningar (Figur 1B). En klassisk FM färgämne experiment att märka en pool av blåsor består i att bada beredningen (bild 1Ai) med färgen under stimulering av nerv (elektriskt eller med höga K +). Detta leder vesikler återvinning och den efterföljande lastning av färgämnet i nyligen endocyteras blåsor (bild 1A I-III). Efter lastning av blåsor med färg, en andra omgång av stimulering i ett färgämne utan badet skulle utlösa FM genom exocytos (bild 1A IV-V), process som kan följas av att övervaka fluorescensintensitet minskning (avfärgning). Även FM-färgämnen har bidragit starkt till området för vesikler återvinning, är det inte möjligt att avgöra det exakta lokalisering eller morfologi av enskilda blåsor med hjälp av konventionella fluorescensmikroskopi. Därför förklarar vi här hur FM-färgämnen kan också användas som endocytic markörer med hjälp av elektronmikroskopi, genom photoconversion. Den photoconversion Tekniken utnyttjar ägs av fluorescerande färger för att generera reaktiva syreradikaler under intensiv belysning. Fluorescerande preparat är nedsänkt i en lösning innehållande Diaminobenzidin (DAB) och belysta. Reaktiva ämnen som genereras av färg molekyler oxiderar DAB, som utgör en stabil, olöslig fällning som har ett mörkt utseende och kan lätt urskiljas i elektronmikroskopi 2,3. Eftersom DAB är bara oxideras i omedelbar närhet av fluorescerande molekyler (som den reaktiva syreradikaler är kortlivade), ser den teknik som bara fluorescerande strukturer kommer att innehålla elektron-täta fällning. Tekniken gör alltså att studera den exakta platsen och morfologi aktivt återvinning organeller.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

FM-färgämnen har varit till ovärderlig hjälp i förståelsen av synaptiska dynamik. FMS är normalt följs under fluorescerande mikroskopet under olika stimulering förhållanden. Dock medger photoconversion av FM färgämnen i kombination med elektronmikroskopi visualisering av olika synaptiska vesikler pooler, bland annat ultrastruktur komponenter, synaptiska boutons.

Studera Synaptic Blås Pools hjälp Photoconversion av Styryl Färgämnen

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analys av Synaptic Blås Pool Påfyllnad i odlade Cerebellar Granule nervceller med hjälp av FM-färgämnen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion och exocytos av membranproteiner i odlade nervceller utvärderas med hjälp av fluorescens återhämtning och fluorescens-förlust fotoblekning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPas vesikelberedning och teknik for Performing Patch Clamp Inspelningar av Submitochondrial Blås Membran

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Undersökning av synaptiska vesikler återvinning Använda FM Färgämnen Under Evoked, Spontan, och miniatyr Synaptic aktiviteter

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Beredning av Synaptic plasmamembranet och Postsynaptiska Density Proteiner hjälp av en kontinuerliga sukrosgradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos i odlade nervceller i hippocampus

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Odling i Vivo-gillar murina astrocyter med snabb, enkel och billig AWESAM-protokollet

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Att kombinera optogenetik med konstgjorda mikroRNA att karakterisera de effekter av genen Knockdown på presynaptiska funktion inom intakt neuronala kretsar

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

En optisk analys för synaptiskt vesikelprotein återvinning i odlade nervceller överuttryck av presynaptiska proteiner

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...