Name: using the gelfree 8100 fractionation system for molecular weight-based fractionation with liquid phase recovery
Uploaded: 2009-12-03T16:30:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery at JoVE.com

1. חלבון לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 500 microfuge μl, לשלב את הפעולות הבאות: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> כרך להוסיף: </td></tr><tr><td> * חלבון המדגם (עד 1 מ&quot;ג) </td><td> עד 112 μL </td></tr><tr><td> מאגר דוגמאות (5X) המסופק בערכה מחסנית </td><td> 30 μL </td></tr><tr><td> DTT 1M </td><td> 8μL </td></tr><tr><td> 18 Ω H 2 O </td><td> x μL לסך של נפח דגימה של 150μL ** </td></tr></tbody></table><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר. </li></ol> * הכמות הכוללת של חלבון להיפרד יהיה תלוי במורכבות של המדגם. לקבלת דוגמאות מורכבות יותר, כגון homogenate רקמות, 150-200 מיקרוגרם לערוץ מומלץ. ** אם היקף המדגם הוא פחות מ 112 μL, להוסיף 18 Ω H 2 O להביא את נפח הסופי μL 150. 2. טוען מחסנית GELFREE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחסנית GELFREE 8100 משקיק את נייר הכסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר להתעלמות אוטם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ אחסון מן התאים מחסנית באמצעות פיפטה. אם כל 8 חדרי מחסנית ישמשו, מחסנית יכול להיות הפוך כדי לרוקן את מאגר אחסון של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחסנית לטעינת ידי הוספת מאגר ריצה GELFREE לכל אחד מתאי מחסנית כדלקמן: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> GELFREE דיו הקאמרית </td><td> נפח הצפת GELFREE ריצה להוסיף </td></tr><tr><td> חיץ האנודה המאגר </td><td> 8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> קטודה מאגר חיץ </td><td> 6 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אוסף לתאי </td><td> 100 μL כל </td></tr></tbody></table><ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים כל חיץ מן החדר טעינת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 150 דגימות μL לתאי טעינה באמצעות pipettor 8 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מחסנית נטען לתוך תחנת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה. מנמיכים את מערכי אלקטרודות ולסגור את המכסה. </li></ol> 3. ריצה את מחסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות התצוגה של מכשיר מסך מגע, לחצו על לחצן שיטה להציג את רשימת מתוכנתים מראש שיטות. כל אחד מתוכנתים מראש שיטות מורכב מתח להגדיר זמן מבוססי הפסקות שנועדו לפתור חלבונים בתוך טווח מסוים של משקל מולקולרי. 8100 GELFREE להשהות באופן אוטומטי לאיסוף חלק במרווחים המפורטים השיטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בשיטה המתאימה זוהה, לחצו על לחצן לאחזר, והזן את המספר של השיטה מתוכנתים מראש הרצוי באמצעות לוח המקשים על המסך. לחץ על OK, ולאחר מכן לחצו על כפתור להחיל. השיטה יושמה יופיע בתחתית המסך הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחור את הערוצים (מספר דוגמאות) אשר ישמשו בטווח, לחצו על לחצן הערוץ על המסך הראשי. כדי לבחור את כל שמונה ערוצים, לחץ על בחר הכל. לאחר מכן, הקש לעשות כדי לחזור למסך הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מכסה בטיחות סגור כי נורית החיווי הירוקה בחלק התחתון של המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את ההפרדה לחלבון, לחצו להתחיל. תחנת ההיפוך חלוקה אוטומטית הפסקה כאשר הגיע הזמן לאסוף את השברים. הערה: כאשר המערכת פועלת, חוגי מוצגים בתיבה בצד שמאל של המסך לתאר את המצב של כל ערוץ. עיגול ירוק עולה כי הערוץ הוא פעיל, עיגול צהוב עולה כי המכשיר כבר עצר, עיגול אדום עולה כי הערוץ נכשל. מתח להחיל וזרמים מוצגים בצד ימין של החוגים מצב הערוץ. שברים צריך רק להיות מוסר כאשר החוגים מעמד הפכו צהוב התראת הטקסט מופיע על המסך של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר שברים, לפתוח את המכסה של המכשיר ולהשתמש ערוץ 8-פיפטה לסגת 150 μL מכל אחד לתאי האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שברים הוסרו, לשטוף את קאמרית אוסף כפול עם הצפת ריצה GELFREE ידי הוספת 100 μl לערוץ ו pipetting למעלה ולמטה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, להוסיף 100uL של GELFREE ריצה הצפת בחזרה לתאי איסוף, לסגור את המכסה, ולחץ על כפתור לחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GELFREE 8100 תוצג עד ההפסקה בפעם הבאה. הזמן הכולל שנותרו הניסוי מוצג בצד ימין של המסך. כדי לעבור בין הזמן שנותר, הזמן שחלף, זמן הפסקה, לחצו על לחצן מעל תיבת הצגת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל החלקים כבר שותףllected, הם יכולים מיד לשמש להכנת במורד נוספים, כגון התמקדות isoelectric או ג&#39;ל אלקטרופורזה, או לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה או immunoaffinity. </li></ol> 4. נציג תוצאות 200 מיקרוגרם של homogenate הכבד שור חולקה 12 שברים בכל, באמצעות מערכת ההיפוך חלוקה GELFREE. 6 μL של כל חלק היה להריץ על ג&#39;ל SDS סטנדרטית לעמוד 1D ומוכתמת כסף. כפי שניתן לראות בתרשים 1, המדגם היה חלבון מופרדים לתוך 12 שברים ברורים, פורש את טווח משקל מולקולרי של 3.5kDa כדי 150kDa. תקן משקל מולקולרי (ColorBurst, Sigma) מוצגים גם מסלולים 1 ו - 14. ג&#39;ל המוצג כאן מדגיש את קצב התאוששות גבוהה מושגת באמצעות מערכת GELFREE 8100 עבור חלוקה חלבון. ג&#39;ל המוצג כאן מייצג 4% של החלבון התאושש 200 מיקרוגרם. <img src="/files/ftp_upload/1842/1842fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /> באיור 1. חלבונים מהכבד שור homogenate מופרדים באמצעות מערכת ההיפוך חלוקה GELFREE. 6 μL של כל חלק 150 μL היה טעון לרוץ על ג&#39;ל SDS 1D דף מוכתם כסף. תקן מולקולרית (MW) משקל היה טעון גם כמצוין. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1842/1842fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol>
	<li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Size+Separation+of+Intact+Proteins+in+Solution+Phase+for+Mass+Spectrometry.">Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry.</a> Anal Chem.. , (2009).</li></ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי גילוי חלבון המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

מערכת 8100 GELFREE ההיפוך חלוקה מספק שיטה מהירה, פשוטה לשעתקו לחלוקת דגימות חלבון מורכב לתוך משקל מולקולרי מבוססי בדידה שברים. זו שיטה חדשה של חלוקה מבטלת את הצורך של הלהקה או חיתוך במקום, מה שהופך אותו ניתן לבודד חלבונים על פני טווח רחב המונית ב 90 דקות. היכולת להעמיס כמויות גדולות יחסית של המדגם להתאושש שברים בשלב נוזל שימושי במיוחד בבידוד וניתוח נמוכה שפע חלבונים, שהם בדרך כלל יותר קשה לזהות. שברים כתוצאה מכך לאחר מכן ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, כגון LC-MS, MALDI-TOF ו immunoblotting.

using the gelfree 8100 fractionation system for molecular weight-based fractionation with liquid phase recovery

מערכת 8100 GELFREE ההיפוך חלוקה היא חלבון רומן חלוקה מערכת שנועדה למקסם התאוששות חלבון במהלך חלוקה משקל מולקולרי מבוסס. מערכת מורכבת של שימוש יחיד, 8 מחסניות מדגם קיבולת כלי GELFREE benchtop ההיפוך חלוקה. במהלך ההפרדה, מתח קבוע מוחל בין האנודה ומאגרי קטודה, וכל תערובת חלבון מונע electrophoretically מתוך חדר טעינה לתוך הג&#39;ל תוכננו במיוחד טור ג&#39;ל. חלבונים מרוכזים ללהקה חזק ג&#39;ל הערמה, והופרדו מבוסס על mobilities electrophoretic שלהם בתוך ג&#39;ל לפתרון. כמו חלבונים elute מהעמודה, הם לכודים והתרכז בשלב נוזלי בתא האיסוף, ללא ג&#39;ל. המכשיר הוא עצר ואז במרווחי זמן מסוים, שברים נאספים בעזרת פיפטה. תהליך זה חוזר על עצמו עד שכל שברים הרצוי נאספו. אם פחות מ 8 דגימות מנוהלות על מחסנית, כל החדרים שאינם בשימוש ניתן להשתמש הפרדות הבאים. טכנולוגיה חדשנית זו מאפשרת הפרדה מהירה ופשוטה של ​​עד 8 תערובות חלבונים מורכבות במקביל, מציע מספר יתרונות בהשוואה לשיטות חלוקה זמין קודם לכן. מערכת זו מסוגלת fractionating עד 1 מ&quot;ג של חלבון הכולל לכל ערוץ, עבור סכום כולל של 8mg בכל מחסנית. חלבונים שלמים על פני טווח רחב מסה מופרדים על בסיס משקל מולקולרי, שמירה על המאפיינים החשובים של physiochemical אנליטי. מלכודת שלב נוזלי מספק עבור התאוששות גבוהה תוך ביטול הצורך הלהקה או חיתוך במקום, מה שהופך את תהליך חלוקה מאוד לשחזור 1.

Watch this Scientific Journal Video about Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery at JoVE.com

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

הסרטון מלווה מתאר את השימוש של מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה, אשר מחיצות דגימות חלבון מורכב על בסיס משקל מולקולרי ומשחזרת את השברים בשלב נוזלי. הסרטון מתאר כיצד הטכנולוגיה עובדת, וכיצד נעשה בו שימוש, ומספק נתונים כתוצאה, עם ניתוח ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide של homogenate מופרדים בכבד בקר.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...