Name: using the gelfree 8100 fractionation system for molecular weight-based fractionation with liquid phase recovery
Uploaded: 2009-12-03T16:30:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery at JoVE.com

1. Подготовка проб белка <ol><li> В 500 мкл трубки микроцентрифужную, объединить следующее: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Том, чтобы добавить: </td></tr><tr><td> * Белки образца (до 1 мг) </td><td> До 112 мкл </td></tr><tr><td> Пример буфера (5X), представленные в комплект картриджей </td><td> 30 мкл </td></tr><tr><td> DTT 1M </td><td> 8μL </td></tr><tr><td> 18 Ω H 2 O </td><td> х мкл в общей сложности выборка объемом 150 мкл ** </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Денатурации образцов при 95 ° С в течение 5 минут. Остудить до комнатной температуры. </li></ol> * Общее количество белка должны быть разделены, будет зависеть от сложности образца. Для более сложных образцов, таких как гомогената ткани, 150-200 мкг в канал рекомендуется. ** Если объем образца составляет менее 112 мкл, добавить 18 Ω H 2 O принести конечного объема до 150 мкл. 2. Загрузка GELFREE картридж <ol><li> Удалить GELFREE 8100 картридж из упаковки. </li><li> Удаляют пластину герметик. </li><li> Удалить хранения буфера из картриджа отсеки с помощью пипетки. Если все 8 палат картридж будет использоваться, картридж может быть обращено для слива хранения буфера из отсеков. </li><li> Подготовка картриджа для загрузки, добавив GELFREE Запуск буфера на каждый из картриджей камеры следующим образом: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> GELFREE патронника </td><td> Объем GELFREE Запуск буфера, чтобы добавить </td></tr><tr><td> Анодный буфер водохранилище </td><td> 8 мл </td></tr><tr><td> Катод буфера водохранилище </td><td> 6 мл </td></tr><tr><td> Коллекция камер </td><td> 100 мкл каждого </td></tr></tbody></table><ol start="5"><li> Удаляют любые буфер из камеры загрузки образца. </li><li> Нагрузка 150 мкл образцов в загрузке камеры использованием 8-канальная пипетка. </li><li> Место загружены картридж в GELFREE 8100 Фракционирование станции. Нижний электрод массивы и закройте крышку. </li></ol> 3. Запуск картридж <ol><li> Использование сенсорного экрана с инструментом, нажмите метод кнопку, чтобы просмотреть список запрограммированных методов. Каждый из запрограммированных методов состоит из множества напряжения и повременной пауз, направленных на решение белков в определенном диапазоне молекулярных масс. GELFREE 8100 автоматически приостановит для фракции коллекцию с интервалами, указанными в методе. </li><li> Как только соответствующий метод был идентифицирован, нажмите кнопку получить, и ввести номер нужного запрограммированных методом с помощью экранной клавиатуры. Нажмите OK, затем нажмите кнопку Применить. Метод, который был применен появится в нижней части главного экрана. </li><li> Для выбора каналов (число выборок), который будет использован в перспективе, пресс кнопку канала на главном экране. Чтобы выбрать все восемь каналов, нажмите Выделить все. Затем нажмите кнопку Готово, чтобы вернуться к главному экрану. </li><li> Убедитесь, что безопасность крышка закрыта, и что индикатор горит зеленым цветом в нижней части экрана. </li><li> Для начала разделения белков, нажмите старт. Фракционирование станция будет автоматически паузы, когда пришло время собирать фракций. Примечание: В то время как система работает, круги показаны в окне слева сторону экрана изображают состояние каждого канала. Зеленый кружок означает, что канал является активным, желтый круг показывает, что прибор сделал паузу, и красный круг показывает, что канал не удалось. Напряжениях и токах, отображаются справа от круга состояния канала. Фракции должны быть удалены только когда статус круги пожелтели и текст сообщения, на экране появляется инструмент с. </li><li> Для удаления фракций, откройте крышку прибора и использовать 8-канальный пипетки отозвать 150 мкл каждого из коллекции камер. </li><li> После фракций были удалены, мыть сборной камеры дважды GELFREE Запуск буфера путем добавления 100 мкл на канал и пипетирования вверх и вниз в два раза. </li><li> После мытья, добавьте 100 мкл из GELFREE Запуск буфера обратно в сборных камер, закройте крышку и нажмите кнопку Возобновить. </li><li> GELFREE 8100 продлится до следующего интервала времени. Общее время оставшиеся в эксперименте показано на правой части экрана. Для переключения между оставшееся время, время прошло, и время паузы, нажмите кнопку выше окно, отображающее время. </li><li> Как только все фракции были совместноllected, они могут сразу же быть использованы для подготовки далее вниз по течению, таких как изоэлектрической фокусировки или гель-электрофореза, или для анализа с использованием жидких масс-спектрометрии хроматографии или иммуноаффинной. </li></ol> 4. Представитель Результаты 200 мкг крупного рогатого гомогената печени была разделена на 12 фракций каждый, используя GELFREE системы фракционирования. 6 мкл каждой фракции работают на стандартные 1D SDS PAGE гель и серебра окрашены. Как показано на рисунке 1, белок образец фракционировали в 12 различных фракций, охватывающих диапазон молекулярного веса от 3.5kDa к 150kDa. Молекулярный вес стандартного (ColorBurst, Sigma) также показаны на дорожках 1 и 14. Гель показано здесь подчеркивается высокой скорости восстановления достигается с помощью GELFREE 8100 системы фракционирования белков. Гель показано здесь составляет 4% белка оправился от 200 мкг. <img src="/files/ftp_upload/1842/1842fig1tmb.jpg" alt="Рисунок 1" border="0" /> Рисунок 1. Белки из печени быка гомогената разделяются с помощью системы GELFREE Фракционирование 6. Мкл 150 мкл каждой фракции загрузки и запуска на 1D SDS PAGE гель и серебра окрашены. Молекулярный вес (МВт) стандарт был загружен, как указано. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1842/1842fig1.jpg">нажмите здесь</a> , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

<ol>
	<li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Size+Separation+of+Intact+Proteins+in+Solution+Phase+for+Mass+Spectrometry.">Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry.</a> Anal Chem.. , (2009).</li></ol>

Авторы этой статьи являются сотрудниками белка Discovery, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

GELFREE 8100 Фракционирование Система обеспечивает быстрый, простой и воспроизводимый метод для разделения сложных образцов белков на отдельные молекулярной массой основе фракций. Этот новый метод фракционирования устраняет необходимость в группу или место резки, что позволяет изолировать белков в широком диапазоне масс в 90 минут. Возможность загрузки относительно большое количество образцов и восстановить фракций в жидкую фазу особенно полезно в изоляции и анализ низким обилием белков, которые обычно труднее обнаружить. В результате фракций может быть использован в широком спектре приложений, таких как LC-MS, MALDI-TOF и иммуноблоттинга.

using the gelfree 8100 fractionation system for molecular weight-based fractionation with liquid phase recovery

GELFREE 8100 Фракционирование Система новую систему фракционирования белка предназначена для максимального восстановления белка во время молекулярного веса основаны фракционирования. Система состоит из одноразовых, 8-образец картриджи повышенной емкости и фракционирования настольный GELFREE инструмента. Во время разделения, постоянное напряжение между анодом и катодом водохранилищ и каждого белка смесь электрофоретически изгнаны из загрузки камеры в специально разработанный гель колонке геля. Белки концентрируются в тугой группу в концентрирующий гель, и обособляться в зависимости от их электрофоретической подвижности в решении геля. Как белка вымывается из колонки, они оказались в ловушке и концентрируется в жидкую фазу в сборной камере, без геля. Прибор остановилась через определенные промежутки времени, а фракции собранные с помощью пипетки. Этот процесс повторяется, пока все требуемые фракции были собраны. Если менее 8 образцов выполняются на картридж, неиспользованные камеры могут быть использованы в последующих увольнений. Это новая технология обеспечивает быстрое и простое разделение до 8 сложных смесей белков одновременно, и имеет ряд преимуществ по сравнению с ранее доступными методами фракционирования. Эта система способна фракционирования до 1 мг общего белка на канал, в общей сложности 8 мг в картридже. Интактных белков в широком диапазоне масс разделены на основе молекулярной массой, сохраняя важные физико-химических свойств вещества. Жидкие фазы захвата обеспечивает высокую восстановления, устраняя необходимость группа или место резки, что делает процесс фракционирования высокой воспроизводимостью 1.

Watch this Scientific Journal Video about Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery at JoVE.com

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Сопровождающее видео описывает использование GELFREE 8100 Фракционирование систему, какие разделы сложных образцов белка на основе молекулярного веса и восстанавливает фракций в жидкую фазу. Видео описывает, как работает технология, как она используется, а также предоставляет полученные данные, с полиакриламидном геле анализ фракционированного бычьего гомогената печени.

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Подготовка и Фракционирование Xenopus laevis Яйцо Экстракты

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

В месте субклеточных Фракционирование Приверженец и не соблюдают клетках млекопитающих

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Полисом фракционирования и анализ млекопитающих Translatomes на генома масштабе

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Изучение белка качества системы управления<em&gt; D. discoideum</em&gt; Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Субцеллюлярные фракционирование Эрк активации на митохондриальной производные пептид лечение

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Графеновый корпус химически фиксированных клеток млекопитающих для жидкой фазовой электронной микроскопии

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...