Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

نشكر المتعاونين لدينا لتقديم عينات من البروتين قيمة ، والتي ساهمت في بعض طرقنا من الخبرة ذات الصلة ، والملاحظات. غونتر Schmalzing قدمت تفضلت الفرصة لFR للانضمام إلى هذا المشروع. وشكرت باربرا أرمبروستر ، برينك يعقوب وديريك ميلز لمساعدتهم المعلقة ومدخلات بشأن المعدات. وقدم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح HL090630.

1. إعداد شبكة من المحاكمات البلورة 2D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدون الكربون المغلفة 400 شبكة النحاس EM الشبكات التي صمة سلبية. وكثيرا ما يستخدم خلات اليورانيل ، ويوفر وصمة طويلة الأمد في مجال التخزين من الحل لعدة أشهر قبل الاستخدام ، فضلا عن صل...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

التقييم السليم للعينات يتطلب تقييم دقيق لعدد كاف من الأغشية. على سبيل المثال ، أعطى العينات مع منخفضة تصل إلى 2 ٪ صفائف البلورية من أصل أكثر من 180 proteoliposomes تصوير المعلومات الهامة عن التحسين السريع لظروف تبلور 2D 7. عندما ترسب ا?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

وقد تطورت الإلكترون البلورات كوسيلة التي يمكن استخدامها كبديل أو بالاشتراك مع ثلاثي الأبعاد وبلورة البلورات بالأشعة السينية لدراسة بنية وظيفة أسئلة للبروتينات الغشاء ، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. الكشف عن بلورات (2D) ثنائي الأبعاد بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (EM) هي خطوة حاسمة في إيجاد ، والأمثل ، واختيار العينات لجمع بيانات عالية الدقة عن طريق البرد EM. نحن هنا وصف الخطوات الأساسية في تحديد كل كبيرة وأمر ، وكذلك المصفوفات 2D الصغيرة ، التي يمكن أن العرض المعلومات قد تكون حاسمة لتحسين ظروف التبلور. من خلال العمل مع تكبير مختلفة في طب الطوارئ ، يتم الحصول على بيانات عن مجموعة من المعلمات حرجة. انخفاض امدادات التكبير بيانات قيمة عن حجم التشكل والأغشية. في أعلى تكبيرا ، ويتم تحديد أبعاد ممكن الكريستال النظام و2D. في هذا السياق ، هو وصفها كيف تستخدم الكاميرات لاتفاقية مكافحة التصحر على الإنترنت ، ويتحول فورييه في أعلى تكبيرا لتقييم proteoliposomes عن النظام والحجم. بينما هي الأكثر شيوعا نمت بلورات 2D للبروتينات غشاء التي كتبها إعادة غسيل الكلى ، وتقنية فحص ينطبق أيضا على بلورات أنتجت بمساعدة monolayers ، 2D الكريستال الأصلي ، وأمرت صفائف من البروتينات القابلة للذوبان. قد بالإضافة إلى ذلك ، الأساليب المذكورة هنا تنطبق على الكشف عن بلورات 2D من أصغر وكذلك بروتينات غشاء أكبر ، حيث أصغر البروتينات تتطلب نفس القدر من العناية في تحديد كأمثلة لدينا وشعرية وأكبر من البروتينات يمكن التعرف بسهولة أكبر في المراحل الأولى من الفرز.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

تقييم ثنائي الأبعاد المحاكمات التبلور (2D) لتشكيل المصفوفات أمرت بروتين الغشاء هو مهمة حرجة وصعبة للغاية في البلورات الإلكترون. نحن هنا وصف نهجنا في الكشف عن وتحديد 2D بلورات صغيرة من بروتينات غشاء الغالب في نطاق 15 -- 90kDa.

تقييم المحاكمات تبلور ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء الصغيرة للدراسات البيولوجيا الهيكلية التي البلوريات الكترون

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

الطبعة Microcontact من البروتينات لبيولوجيا الخلية

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

التصور من ATP سينسيز Dimers في الميتوكوندريا بواسطة الكترون البرد المقطعي

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...