Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Wij danken onze medewerkers voor het leveren van waardevolle eiwitten monsters, die hebben bijgedragen tot een aantal van onze methodes met betrekking ervaring en observaties. Günther Schmalzing vriendelijk de gelegenheid om FR om dit project aan te sluiten. Barbara Armbruster, Jacob Brink en Deryck Mills worden bedankt voor hun uitstekende hulp en inbreng van de apparatuur. De financiering werd verstrekt door NIH subsidie ​​HL090630.

1. Grid Voorbereiding van de 2D-Kristallisatie Trials <ol><li> Koolstof beklede 400-mesh koper EM roosters worden voorbereid door een negatieve vlek. Uranylacetaat wordt veelvuldig gebruikt en biedt een langdurige op het gebied van opslag van de oplossing vlek voor enkele maanden voordat gebruik en geschikt voor langdurige opslag van netten. In tegenstelling tot andere negatieve vlekken zoals uranyl formaat, terwijl het een uitstekende kleuring, moet vers worden gemaakt 1. Voor een snelle bereiding van een ...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Goede evaluatie van monsters vereist een zorgvuldige evaluatie van een voldoende aantal van membranen. Bijvoorbeeld, monsters met zo laag als 2% kristallijn arrays uit van meer dan 180 afgebeeld proteoliposomen gaf essentiële informatie voor een snelle optimalisatie van de 2D-kristallisatie voorwaarden 7. Als neerslag van het eiwit optreedt, kan een rooster worden afgezien van verdere screening na de inspectie bij een lage vergroting, hoewel af en toe een gedeeltelijke neerslag v...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Electron kristallografie heeft zich ontwikkeld als een methode die kan als alternatief of in combinatie met een drie-dimensionale kristallisatie en X-ray kristallografie om structuur-functie vragen van membraaneiwitten, evenals oplosbare eiwitten studie worden gebruikt. Screening voor twee-dimensionale (2D) kristallen door transmissie elektronenmicroscopie (EM) is de belangrijkste stap in het vinden van, het optimaliseren, en het selecteren van monsters voor hoge-resolutie de gegevensverzameling door de cryo-EM. Hier beschrijven we de fundamentele stappen in het identificeren van zowel grote en beval, evenals kleine 2D-arrays, dat kritieke informatie kan mogelijk leveren voor de optimalisatie van kristallisatie omstandigheden. Door te werken met verschillende vergrotingen op de EM, worden gegevens over een reeks van kritische parameters verkregen. Lagere vergroting levert waardevolle gegevens op de morfologie en de membraan grootte. Bij hogere vergrotingen, zijn mogelijk orde en 2D-kristallen afmetingen bepaald. In dit kader wordt beschreven hoe de CCD-camera&#39;s en de online-Fourier transformaties worden gebruikt bij hogere vergrotingen te proteoliposomen voor orde en grootte te beoordelen. Terwijl de 2D-kristallen van membraaneiwitten worden meestal geteeld door reconstitutie door middel van dialyse, de screening techniek is evenzeer van toepassing is voor de kristallen geproduceerd met behulp van monolagen, inheemse 2D-kristallen, en bestelde arrays van oplosbare eiwitten. Daarnaast is de hier beschreven methoden zijn van toepassing op de screening voor 2D kristallen van nog kleinere en grotere membraaneiwitten, waar kleinere eiwitten dezelfde hoeveelheid zorg nodig hebben in de identificatie als onze voorbeelden en het rooster van grotere eiwitten zouden meer herkenbaar worden in eerdere stadia van de screening.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...