Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Nous remercions nos collaborateurs pour fournir des échantillons de protéines précieuses, qui ont contribué à certaines de nos méthodes relatives expérience et les observations. Günther Schmalzing aimablement fourni l&#39;occasion de FR à rejoindre ce projet. Barbara Armbruster, Jacob Brink et Mills Deryck sont remerciés pour leur aide exceptionnelle et d&#39;entrée sur l&#39;équipement. Le financement a été fourni par NIH HL090630.

1. Préparation Grille des essais de cristallisation 2D <ol><li> Revêtues de carbone de 400 mailles de cuivre EM grilles sont préparés par coloration négative. L&#39;acétate d&#39;uranyle est fréquemment utilisé et fournit une tache de longue durée en termes de stockage de la solution pendant plusieurs mois avant de les utiliser, ainsi que l&#39;aptitude à l&#39;entreposage à long terme des réseaux. En revanche, d&#39;autres taches négatifs tels que le formiate d&#39;uranyle, tout en offrant une excellente...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Évaluation appropriée des échantillons requiert un examen minutieux d&#39;un nombre suffisant de membranes. Par exemple, des échantillons avec aussi peu que 2% de réseaux cristallins sur plus de 180 protéoliposomes imagés ont donné des informations essentielles pour l&#39;optimisation rapide des conditions de cristallisation 2D 7. Lorsque la précipitation de la protéine se produit, une grille pourrait être abandonné d&#39;un dépistage supplémentaire après l&#39;insp...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> 400-maille des grilles de cuivre recouvertes de TEM film de carbone </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> pince: régulière et anti-capillaire </td><td></td><td></td><td></td><td> Dumont # 5 et Dumont N5AC ou similaire </td></tr><tr><td> Micropipette et pointes de pipette </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Whatman n ° 4 papier filtre </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> 1% d&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Dialyse samsonnes à subir un dépistage de cristaux 2D </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Glycérol / saccharose sans tampon de dialyse </td><td></td><td></td><td></td><td> En option </td></tr><tr><td> JEOL-1400 microscope électronique à transmission (MET) </td><td></td><td></td><td></td><td> semblable 80 - 120 kV TEM équipé d&#39;un filament de tungstène ou de LaB6 et le film et / ou des caméras CCD (Gatan Orius SC1000 et / ou UltraScan1000 caméras CCD et Gatan Digitial progiciel Micrograph ou caméras Tietz (TVIPS)) </td></tr></tbody></table></div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Cristallographie électronique a évolué comme une méthode qui peut être utilisée alternativement ou en combinaison avec trois dimensions cristallisation et cristallographie aux rayons X pour étudier la structure-fonction des questions de protéines membranaires, ainsi que des protéines solubles. Dépistage des cristaux bidimensionnels (2D) par microscopie électronique à transmission (EM) est l&#39;étape cruciale dans la recherche, l&#39;optimisation et la sélection des échantillons de haute résolution collecte de données par cryo-EM. Nous décrivons ici les étapes fondamentales de l&#39;identification à la fois vaste et ordonné, ainsi que de petits tableaux 2D, qui peut potentiellement fournir des informations essentielles pour l&#39;optimisation des conditions de cristallisation. En travaillant avec différents grossissements les EM, les données sur une gamme de paramètres critiques est obtenue. Faible grossissement fournit de précieuses données sur la morphologie et la taille de la membrane. À forts grossissements, une éventuelle dimension de cristal de commande et 2D sont déterminés. Dans ce context, il est décrit comment caméras CCD et en ligne des transformées de Fourier sont utilisés à forts grossissements pour évaluer protéoliposomes pour l&#39;ordre et la taille. Tandis que les cristaux 2D de protéines membranaires sont le plus souvent augmenté par reconstitution par dialyse, la technique de criblage est également applicable pour les cristaux produits à l&#39;aide de cristaux natifs monocouches, 2D, et des matrices ordonnées de protéines solubles. En outre, les méthodes décrites ici sont applicables à la projection de cristaux 2D de même plus petit ainsi que des protéines membranaires plus grandes, où les petites protéines nécessitent la même quantité de soins dans l&#39;identification que nos exemples et le treillis de grandes protéines pourraient être plus facilement identifiable aux premiers stades de la projection.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Évaluer bidimensionnelles (2D essais de cristallisation) pour la formation de réseaux classés protéine membranaire est une tâche difficile et très critique dans cristallographie électronique. Ici, nous décrivons notre approche dans le dépistage et l&#39;identification des cristaux 2D de protéines membranaires principalement des petites de l&#39;ordre de 15 - 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Impression par microcontact de protéines pour la biologie cellulaire

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Recherche

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d&#39;insectes pour les études biophysiques

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...