Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
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हम बहुमूल्य प्रोटीन के नमूने, जो हमारे तरीके से संबंधित अनुभव और टिप्पणियों के कुछ योगदान प्रदान करने के लिए अपने सहयोगियों का धन्यवाद. गुंठर Schmalzing कृपया FR करने का अवसर प्रदान करने के लिए इस परियोजना में शामिल होने. बारबरा Armbruster, याकूब कगार और Deryck मिल्स उनके बकाया मदद और उपकरणों पर इनपुट के लिए धन्यवाद दिया. अनुदान NIH अनुदान HL090630 द्वारा प्रदान की गई थी.

1. 2D Crystallization परीक्षण के ग्रिड तैयार <ol><li> कार्बन लेपित 400 जाल तांबा EM ग्रिड नकारात्मक दाग द्वारा तैयार कर रहे हैं. Uranyl एसीटेट अक्सर प्रयोग किया जाता है और उपयुक्तता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्रिड के दी?...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

नमूनों के उचित मूल्यांकन झिल्ली के एक पर्याप्त संख्या के सावधान मूल्यांकन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में कम 2% के रूप में 180 से अधिक imaged proteoliposomes की क्रिस्टलीय सरणियों के साथ नमूने 2D crystallization 7 शर्त?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

इलेक्ट्रॉन क्रि एक तरीका है कि या तो वैकल्पिक रूप से या तीन आयामी crystallization और एक्स - रे क्रि झिल्ली प्रोटीन की संरचना समारोह सवाल है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घुलनशील प्रोटीन का अध्ययन करने के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में विकसित किया गया है. दो आयामी (2d) के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा क्रिस्टल के लिए स्क्रीनिंग (EM) को ढूँढने में महत्वपूर्ण कदम है, अनुकूलन, और क्रायो-EM द्वारा उच्च संकल्प डेटा संग्रह के लिए नमूने का चयन. यहाँ हम दोनों बड़े और आदेश दिया, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छोटे 2 डी सरणियों, कि संभावित crystallization शर्तों के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण जानकारी की आपूर्ति कर सकते हैं की पहचान करने में बुनियादी कदम का वर्णन. EM पर विभिन्न magnifications के साथ काम करके, महत्वपूर्ण पैरामीटर की एक श्रृंखला पर डेटा प्राप्त की है. लोअर बढ़ाई आकारिकी और झिल्ली के आकार पर मूल्यवान डेटा की आपूर्ति करता है. उच्च magnifications में, संभव क्रम और 2d क्रिस्टल आयाम निर्धारित होते हैं. इस संदर्भ में, यह वर्णित है कैसे सीसीडी कैमरों और ऑनलाइन - फूरियर रूपांतरण उच्च magnifications पर इस्तेमाल कर रहे हैं करने के लिए आदेश और आकार के लिए proteoliposomes का आकलन है. जबकि झिल्ली प्रोटीन की 2D क्रिस्टल सबसे अधिक डायलिसिस द्वारा पुनर्गठन द्वारा बड़े हो रहे हैं, स्क्रीनिंग तकनीक monolayers, देशी 2D क्रिस्टल की मदद के साथ उत्पादित क्रिस्टल के लिए समान रूप से लागू है, और घुलनशील प्रोटीन की सरणियों का आदेश दिया. इसके अलावा, यहाँ वर्णित विधियों को भी छोटे 2 डी क्रिस्टल के रूप में अच्छी तरह के रूप में बड़ा झिल्ली प्रोटीन, जहां छोटे प्रोटीन की पहचान में हमारे बड़े प्रोटीन की जाली और उदाहरण के रूप में देखभाल के एक ही राशि की आवश्यकता के लिए स्क्रीनिंग के लिए लागू कर रहे हैं और अधिक आसानी से पहचाने जाने योग्य हो सकता है स्क्रीनिंग के पहले चरण में.

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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

आदेश दिया झिल्ली प्रोटीन arrays के गठन के लिए दो आयामी (2d) crystallization परीक्षण का मूल्यांकन इलेक्ट्रॉन क्रि में एक बेहद महत्वपूर्ण और मुश्किल काम है. 90kDa - हम यहाँ के लिए स्क्रीनिंग और 15 की रेंज में मुख्य रूप से छोटे झिल्ली प्रोटीन की 2D क्रिस्टल की पहचान में हमारे दृष्टिकोण का वर्णन.

स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के अध्ययन के लिए इलेक्ट्रॉन क्रि द्वारा लघु झिल्ली प्रोटीन के दो आयामी Crystallization परीक्षण मूल्यांकन

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

सेल बायोलॉजी के लिए प्रोटीन के microcontact मुद्रण

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

एक्स - रे क्रि के लिए प्रोटीन Crystallization

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

झिल्ली प्रोटीन के lipídic Mesophases में Crystallization

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Lipídic Bicelle विधि का प्रयोग झिल्ली प्रोटीन की उच्च throughput Crystallization

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

झिल्ली macromolecular क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचना निर्धारण के लिए lipidic Mesophases में बढ़ी प्रोटीन की कटाई और क्रायो ठंडा कण

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए लिपिड झिल्ली में एक केवी चैनल का पुनर्गठन

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

के कुशल उत्पादन और शोधन संयोजक Murine Kindlin -3 की biophysical अध्ययन के लिए कीट कोशिकाओं से

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी द्वारा mitochondria में एटीपी synthase dimers के दृश्य

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...