Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
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Ringraziamo i nostri collaboratori per la fornitura di campioni di proteine ​​di valore, che ha contribuito ad alcune delle nostre esperienze e le osservazioni relativi metodi. Günther Schmalzing gentilmente fornito l&#39;opportunità di FR di aderire a questo progetto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills Si ringraziano per il loro aiuto eccezionale e di ingresso delle apparecchiature. Il finanziamento è stato fornito dal NIH concedere HL090630.

1. Preparazione della griglia di prove di cristallizzazione 2D <ol><li> Carbonio rivestite 400-maglia di rame EM griglie sono preparati da macchia negativa. Acetato di uranile è usato frequentemente e offre una lunga macchia in termini di conservazione della soluzione per diversi mesi prima di utilizzarlo così come idoneità conservazione a lungo termine delle reti. Al contrario, altre macchie negative come formiato di uranile, fornendo colorazione eccellente, devono essere appena fatto 1. Per la preparaz...

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	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Corretta valutazione dei campioni esige un&#39;attenta valutazione di un numero sufficiente di membrane. Per esempio, i campioni con più basso del 2% array cristallino di oltre 180 proteoliposomi ripreso ha dato delle informazioni critiche per l&#39;ottimizzazione rapida delle condizioni di cristallizzazione 2D 7. Quando precipitazione delle proteine ​​si verifica, una griglia potrebbe essere abbandonata dallo screening ulteriormente dopo l&#39;ispezione a basso ingrandimento...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Cristallografia elettroni si è evoluto come un metodo che può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con tridimensionale cristallizzazione e cristallografia a raggi X per lo studio struttura-funzione domande di proteine ​​di membrana, così come proteine ​​solubili. Screening per bidimensionali (2D) i cristalli di microscopia elettronica a trasmissione (EM) è un passaggio fondamentale nella ricerca, l&#39;ottimizzazione e selezione dei campioni ad alta risoluzione di raccolta dati da Cryo-EM. Qui si descrivono le tappe fondamentali nell&#39;identificazione grandi e ordinato, così come piccoli array 2D, che possono potenzialmente fornire informazioni critiche per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Grazie alla collaborazione con diversi ingrandimenti a EM, dati su una serie di parametri critici si ottiene. Ingrandimento inferiore fornisce dati preziosi sulle dimensioni e morfologia della membrana. A maggiore ingrandimento, dimensioni possibili cristallo ordine e 2D sono determinati. In questo contesto, è descritto come CCD e online-trasformate di Fourier sono utilizzati a più alto ingrandimento per valutare proteoliposomi per l&#39;ordine e la dimensione. Mentre cristalli 2D di proteine ​​di membrana sono più comunemente coltivate mediante ricostituzione con la dialisi, la tecnica di screening è ugualmente applicabile per i cristalli di prodotto con l&#39;aiuto di monostrati, nativo cristalli 2D, e ha ordinato gli array di proteine ​​solubili. Inoltre, i metodi qui descritti sono applicabili alla proiezione di cristalli 2D di ancora più piccoli così come proteine ​​di membrana più grande, dove proteine ​​più piccole richiedono la stessa quantità di cura per l&#39;identificazione come il nostro esempio e il reticolo di proteine ​​più grandi potrebbero essere più facilmente identificabili nelle prime fasi dello screening.

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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l&#39;individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

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