Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
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我々は我々の方法に関連する経験と観察のいくつかに貢献し、貴重なタンパク質サンプルを、提供するための私達の協力者に感謝する。ギュンターSchmalzingは親切にこのプロジェクトに参加するFRする機会を提供した。バーバラArmbruster氏、ヤコブブリンクとデリックミルズは、その卓越したヘルプや機器の入力のために感謝されています。資金は、NIHの助成金HL090630によって提供されていました。

1。二次元結晶化トライアルのグリッドの準備<ol><li>炭素でコーティングされた400メッシュ銅EMグリッドは負染色することによって調製される。酢酸ウラニルは、頻繁に使用され、長期的なグリッドの長期保存のための使用だけでなく、適合性の前に数ヶ月のためのソリューションのストレージの条件で染色を提供しています。対照的に、このようなウラニルギなどの他の負の汚れ、優れた?...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

サンプルの適切な評価は、膜の十分な数の慎重な評価が必要です。例えば、180以上の画像化されたプロテオリポソームの外のような低％2などの結晶配列を持つ試料は二次元結晶化の条件7の迅速な最適化のための重要な情報を与えた。 タンパク質の時折部分的沈殿が発生したものの、タンパク質の沈殿が発生すると、グリッドは、低倍率での検査の後、さらにス?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

電子線結晶学は、どちらかあるいは、または構造と機能膜タンパク質の質問だけでなく、可溶性タンパク質を研究するために三次元結晶化とX線結晶構造解析と組み合わせて使用​​することができる手法として発展してきた。透過型電子顕微鏡による二次元（2D）の結晶のスクリーニングは、（EM）を最適化し、低温電子顕微鏡による高分解能のデータ収集のためのサンプルを選択し、見つけるのに重要なステップです。ここでは、潜在的に結晶化条件の最適化に重要な情報を供給できるよう、大規模および順序だけでなく、小規模な2次元配列の両方を識別するための基本的な手順を説明します。 EMで異なる倍率で作業することによって、重要なパラメータの範囲のデータが得られる。低倍率では、形態や膜サイズで貴重なデータを提供しています。より高い倍率で、可能な限り順番と二次元結晶の寸法が決定されます。この文脈では、CCDカメラとオンライン - フーリエ変換は、順序とサイズのためのプロテオリポソー​​ムを評価するために高倍率で使用されているか説明しています。 膜タンパク質の2次元結晶は、最も一般的に透析して再構成によって栽培されているが、スクリーニングの手法は、単層、ネイティブの2Dクリスタルの助けを借りて生産結晶の等しく適用可能である、と可溶性タンパク質の配列を命じた。さらに、ここで説明する方法は、さらに小さいの2D結晶だけでなく、私たちの例と大規模なタンパク質の格子がより容易に識別できる可能性があるとしても小さい蛋白質が同定におけるケアの同じ量を必要とする大規模な膜タンパク質のスクリーニングに適用可能である審査の早い段階で。

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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

注文した膜タンパク質アレイの形成のために2次元（2D）の結晶化試験を評価すると、電子線結晶学における非常に重要かつ困難な作業です。 90kDa - ここでは、のためにスクリーニングし、15の範囲で主に小型の膜タンパク質の2次元結晶の同定に我々のアプローチを説明します。

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...