Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Vi tackar våra samarbetspartners för att ge värdefullt protein prover, vilket bidrog till några av våra metoder relaterade erfarenhet och observationer. Günther Schmalzing förutsatt vänligt möjlighet till FR att gå med detta projekt. Barbara Armbruster, Jacob Brink och Deryck Mills är tack för deras enastående hjälp och synpunkter på utrustning. Finansieringen kom från NIH bidrag HL090630.

1. Grid Beredning av 2D Crystallization Trials <ol><li> Kolbelagda 400-nät koppar EM nät bereds av negativa fläcken. AUC acetat används ofta och ger en långvarig fläck när det gäller lagring av lösningen i flera månader före användning samt lämplighet för långtidslagring av nät. Däremot andra negativa fläckar som AUC formiat, samtidigt som den ger utmärkt färgning, måste nybakade 1. För snabb beredning av ett stort antal nät som ska användas för screening av 2D kristallisering pröv...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Ordentlig utvärdering av prov kräver en noggrann bedömning av ett tillräckligt antal av membran. Till exempel gav prover med så låg som 2% kristallin matriser av över 180 avbildas proteoliposomes kritisk information för snabb optimering av 2D kristallisering villkor 7. När utfällning av proteinet sker, kan ett rutnät läggas ned från ytterligare screening efter inspektion vid låg förstoring, även om enstaka delar utfällning av protein sker. Även mycket små membra...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Electron kristallografi har utvecklats som en metod som kan användas antingen alternativt eller i kombination med tredimensionella kristallisation och röntgenkristallografi för att studera struktur och funktion frågor om membranproteiner, samt lösliga proteiner. Screening för tvådimensionella (2D) kristaller av transmissionselektronmikroskop (EM) är den kritiska steget i att hitta, optimering och välja ut provexemplar för hög upplösning datainsamling av Cryo-EM. Här beskriver vi de grundläggande stegen i att identifiera såväl stora som beställts, samt små 2D-arrayer, som potentiellt kan leverera kritisk information för optimering av kristallisering villkor. Genom att arbeta med olika förstoring på EM, är uppgifter om ett antal kritiska parametrar erhållits. Lägre förstoring levererar värdefulla data på morfologi och membran storlek. Vid högre förstoring är möjliga för-och 2D kristall dimensioner bestäms. I detta sammanhang är det beskrivs hur CCD-kameror och online-Fouriertransformer används vid högre förstoringar att bedöma proteoliposomes för beställning och storlek. Även om 2D-kristaller av membranproteiner är oftast vuxit med beredning av dialys, är screening tekniken lika tillämpliga för kristaller som produceras med hjälp av monolager, infödda 2D-kristaller, och beställde arrayer av lösliga proteiner. Dessutom, de metoder som beskrivs här gäller för screening för 2D-kristaller av ännu mindre såväl som större membranproteiner, där mindre proteiner kräver samma mängd vård i identifiering våra exempel och galler av större proteiner kan vara lättare att identifiera i tidigare skeden av screening.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Utvärdering av tvådimensionella (2D) kristallisering prövningar för bildandet av beställda arrayer membranprotein är en mycket viktig och svår uppgift i elektron kristallografi. Här beskriver vi vår strategi i screening för och identifiera 2D kristaller i framför allt små membranproteiner i intervallet 15 - 90kDa.

Bedöma Tvådimensionella Kristallisering Trials of Small Membrane proteiner för strukturbiologi studier av elektron Kristallografi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Microcontact utskrift av proteiner för cellbiologi

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Protein Kristallisering för röntgenkristallografi

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Beredning av ett Kv Channel i lipidmembraner för strukturella och funktionella studier

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion och rening av rekombinant Murina Kindlin-3 från insektsceller för biofysikalisk Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering av ATP-syntas dimerer i Mitokondrier från Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...