Name: assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Biz bazı yöntemleri ile ilgili deneyim ve gözlemler katkıda bulunan değerli protein örnekleri, sağlamak için bizimle işbirliği yapanlara teşekkür ediyorum. Günther Schmalzing lütfen bu projeye katılmaya FR için fırsat sağladı. Barbara Armbruster, Jacob Brink ve Deryck Mills olağanüstü yardım ve ekipman giriş için teşekkür. Finansman NIH hibe HL090630 tarafından sağlanmıştır.

1. 2B Kristalizasyon Denemeler Izgara Hazırlama <ol><li> Karbon-400-mesh kaplı bakır EM ızgaraları negatif leke tarafından hazırlanmıştır. Uranil asetat sık kullanılan ve ızgaraları uzun süreli depolama için kullanımının yanı sıra uygunluğu önce birkaç ay boyunca uzun süreli bir çözüm depolama açısından leke sağlar. Buna karşılık, uranil format gibi diğer olumsuz lekeleri, mükemmel boyama sağlarken, taze 1 yapılabilir. Izgaraları 2D kristalizasyon çalışmaların tar...

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Uygun değerlendirme örneklerinin membran yeterli sayıda dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Örneğin, 180 üzerinden görüntülü proteoliposomes düşük% 2 olarak kristal dizileri örnekleri 2D kristalizasyon koşullarına hızlı optimizasyon 7 için kritik bilgi verdi. Zaman zaman kısmi protein yağış görülse de, bir ızgara protein yağış oluştuğunda, düşük büyütmede incelemeden sonra, daha fazla tarama terk olabilir. Olsa bile çok az 100 nm küçük m...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Elektron kristalografisi, ya alternatif olarak veya membran proteinlerinin yapı-işlev sorular, eriyen proteinlerin yanı sıra çalışma, üç boyutlu kristalizasyon ve X-ışını kristalografisi birlikte kullanılabilecek bir yöntem olarak gelişti. Transmisyon elektron mikroskobu ile iki boyutlu (2D) kristalleri için tarama (EM) optimize ve cryo-EM tarafından yüksek çözünürlüklü veri toplama için örnekler seçerek bulma kritik bir adımdır. Burada potansiyel kristalizasyon koşullarının optimizasyonu için kritik bilgi kaynağı olabilir, büyük ve sipariş yanı sıra küçük 2D dizileri belirlenmesinde temel adımları açıklar. EM farklı büyütme ile çalışarak, bir dizi kritik parametreleri veri elde edilir. Alt büyütme, morfolojisi ve membran boyutu değerli veri sağlamaktadır. Yüksek büyütmeler, düzen ve 2D kristal boyutları belirlenir. Bu bağlamda, yüksek büyütmelerde kullanılan CCD kamera ve online-Fourier Dönüşümleri düzen ve boyutu için proteoliposomes değerlendirmek için nasıl tarif edilir. Membran proteinlerinin 2D kristalleri diyaliz ile sulandırıldıktan en yaygın olarak yetiştirilen, tarama tekniği, mono tabakaları, yerli 2D kristaller yardımıyla üretilen kristal için de geçerlidir ve çözünür proteinler dizileri emretti. Buna ek olarak, burada açıklanan yöntemleri büyük proteinler ve bizim örnek ve kafes gibi küçük proteinlerin belirlenmesinde aynı miktarda bakım gerektiren daha küçük 2D kristalleri gibi büyük membran proteinleri, tarama daha kolay tanımlanabilir olabilir tarama önceki aşamada.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Proteinlerin Hücre Biyolojisi Microcontact Baskı

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...