Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Dit protocol werd ontwikkeld in de laboratoria van Jane Dodd, Thomas Jessell en Andrew Lumsden. Veel mensen, waaronder Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba en Toshiya Yamada bepaald hoe de cultuur explantaten van het ruggenmerg in collageen. Marysia Placzek en Marc Tessier-Lavigne een pionier in de techniek van het gebruik van axon groei van in vitro explantaten als een middel ter identificatie van axon begeleiding moleculen. Werk in het laboratorium Butler wordt ondersteund door subsidies van de March of Dimes en R01 NS063999 van NIH / NINDS.

Deel 1: Voorbereiding van aggregaten van getransfecteerde COS-cellen met behulp van Opknoping Drops <ol><li> Zaad COS-7 (COS) cellen in 35mm cultuur gerechten. Als ze 80% confluentie, transfecteren 1μg van de expressie plasmide in de cellen met behulp van Lipofectamine2000 volgens de fabrikant s-protocol te bereiken. </li><li> Ter voorbereiding opknoping daalt, zuigen de transfectie medium en spoel de getransfecteerde COS cellen met 1 ml 1x fosfaat gebufferde oplossing (PBS). Behandel cellen met 0,5 ml van het enzym-...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

De kritische factoren die het succes bij het uitvoeren van deze test bepalen eerst worden, het weefsel niet moeten worden behandeld met dispase voor te lange periode, zal leiden tot een dergelijke behandeling in het weefsel steeds erg plakkerig en met verminderde levensvatbaarheid. Twee, moet het collageen perfect geprepareerd en bewaard op ijs zo veel mogelijk. Het zal steeds moeilijker te hanteren als het begint ingesteld, dat wil zeggen roze. Drie, moet de wolfraam naald altijd worden bewaard zeer scherp.

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Dorsale commissural axonen in de gewervelde ruggenmerg 1 zijn een onschatbare waarde model systeem in te axon begeleiding signalen te identificeren. We beschrijven hier een in vitro test, &quot;de heroriëntatie assay&quot;, dat is uitgebreid gebruikt om het effect van extrinsieke en intrinsieke signalen studie over de oriëntatie van commissural axonen 2. Deze test werd ontwikkeld door een groot aantal mensen in de laboratoria van Jane Dodd, Thomas Jessell en Andrew Lumsden (zie erkenningen voor meer details) en de versies van deze test werden gebruikt om de heroriëntatie van de belangrijkste activiteiten axon begeleiding moleculen aan te tonen, waaronder de BMP chemorepellent in de dakplaat 3,4 en de chemoattractive activiteiten van Netrin1 5 en Sonic Hedgehog (Shh) 6 in de vloerplaat in het ruggenmerg. Explantaten bestaande uit 2-3 segmenten van de dorsale tweederde van het ruggenmerg zijn ontleed uit embryonale dag (E) 11 ratten en gekweekt in driedimensionale collageen gels 7. E11 dorsale wervelkolom explantaten bevatten pasgeboren commissural neuronen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun axonale expressie van het glycoproteïne, Tag1 8. In de loop van 30-40 uur in de cultuur, is de commissural axon traject samengevat in deze dorsale explantaten met een tijdsverloop vergelijkbaar met dat in vivo. Dit axonale traject kan worden aangevochten door het plaatsen van een te testen weefsels of een COS-cel aggregaat uiten van een kandidaat signaalmolecuul in contact met een van de zijkanten van de dorsale explantaat. Commissural axonen te breiden in de omgeving van de bijgevoegde weefsel zal groeien onder invloed van zowel de endogene dakplaat en de signalen van de ectopische laterale weefsel. De mate waarin commissural axonen worden geheroriënteerd onder deze omstandigheden kunnen worden gekwantificeerd. Met behulp van deze test, is het mogelijk zowel te onderzoeken of het toereikendheid van een bepaald signaal om te heroriënteren commissural axonen 3,4 en de noodzaak voor dit signaal aan de commissural traject 9 direct.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.

Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Fabricage van een microfluïdische apparaat voor de compartimentering van Neuron Soma en axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrofysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...