Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
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Dieses Protokoll wurde in den Labors von Jane Dodd, Thomas Jessell und Andrew Lumsden entwickelt. Viele Menschen, darunter Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba und Toshiya Yamada bestimmt, wie die Kultur Explantate des Rückenmarks in Kollagen. Marysia Placzek und Marc Tessier-Lavigne Pionier in der Technik der Verwendung von Axon-Wachstum von in vitro Explantate als Mittel zur Identifizierung von Axon Führung Moleküle. Die Arbeit in der Butler Labor ist durch Zuschüsse der March of Dimes und R01 NS063999 von NIH / NINDS unterstützt.

Teil 1: Vorbereitung der Aggregate von transfizierten COS-Zellen mit hängenden Tropfen <ol><li> Seed COS-7 (COS)-Zellen in 35-mm-Kulturschalen. Als sie 80% Konfluenz, transfizieren 1 g des Expressionsplasmids in die Zellen mit Lipofectamine2000 nach Angaben des Herstellers s-Protokoll zu erreichen. </li><li> Zur Vorbereitung hängenden Tropfen absaugen Transfektionsmedium und spülen Sie die transfizierten COS-Zellen mit 1 ml 1x Phosphat-gepufferte Lösung (PBS). Gönnen Zellen mit 0,5 ml Enzym-freie Zelle Dissoziati...

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	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

Die kritischen Faktoren, die den Erfolg bei der Durchführung dieses Tests bestimmen, sind erstens die Gewebe nicht mit Dispase für zu lange einen Zeitraum behandelt werden, wird eine solche Behandlung in das Gewebe zu sehr klebrig und mit verminderter Tragfähigkeit führen. Zwei, muss das Kollagen perfekt vorbereitet werden und auf Eis gehalten so viel wie möglich. Es wird zunehmend schwieriger zu handhaben, wenn sie gesetzt beginnt, dh sich rosa färben. Drei, muss der Wolfram-Nadel stets sehr scharf sein.

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Dorsal kommissuralen Axone in der Wirbeltier-Rückenmark 1 haben einen unschätzbaren Modell, in dem Axon Führung Signale zu identifizieren gewesen. Hier beschreiben wir ein In-vitro-Assay, &quot;die Neuausrichtung assay&quot;, die verwendet wurde ausgiebig um die Wirkung von äußeren und inneren Signale von der Orientierung der Axone kommissuralen-2-Studie. Dieser Test wurde von zahlreichen Menschen in den Labors von Jane Dodd, Thomas Jessell und Andrew Lumsden entwickelt (siehe Anerkennungen für weitere Details) und Versionen dieses Tests wurden verwendet, um die Neuausrichtung Aktivitäten der Schlüssel Axon Führung Moleküle nachzuweisen, einschließlich der BMP chemorepellent in der Dachblech 3,4 und die chemoattractive Aktivitäten Netrin1 5 und Sonic Hedgehog (SHH) 6 in die Bodenplatte in das Rückenmark. Explantate aus 2-3 Segmenten der dorsalen zwei Drittel des Rückenmarks sind aus embryonalen Tag (E) 11 Ratten seziert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen 7. E11 dorsalen Explantate enthalten neu geboren kommissuralen Neuronen, die durch ihre axonalen Ausdruck des Glykoprotein, Tag1 8 identifiziert werden können. Im Laufe von 30-40 Stunden in Kultur, ist die kommissuralen Axon Flugbahn in diesen dorsalen Explantate mit einer zeitlichen Verlauf ähnlich dem in vivo gesehen rekapituliert. Diese Axone Flugbahn kann, indem entweder Test Gewebe oder eine COS-Zelle aggregieren Ausdruck eines Kandidaten Signalmolekül in Kontakt mit einem der seitlichen Ränder der dorsalen Explantation angefochten werden. Kommissuralen Axone, die sich in der Nähe der beigefügten Gewebe wird unter dem Einfluss der beiden endogenen Dachblech und Signale aus der ektopischen seitlichen Gewebe wachsen. Der Grad der kommissuralen Axone unter diesen Umständen neu ausgerichtet werden kann quantifiziert werden. Unter Verwendung dieses Tests ist es möglich, sowohl auf die Angemessenheit eines bestimmten Signals, um neu zu orientieren kommissuralen Axone 3,4 sowie die Notwendigkeit für dieses Signal an die kommissuralen Flugbahn 9 direkte untersuchen.

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dieser Test bewertet die Fähigkeit eines Signalmolekül, hier Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), um kommissuralen Axone neu zu orientieren. Eine Explantation von embryonalen Rückenmark kultiviert wird neben einem Aggregat von COS-Zellen sekretieren der Kandidat Wachstumsfaktoren. Umorientiert kommissuralen Axone wachsen innerhalb der Explantation werden visualisiert durch Immunhistochemie.

Testen der Fähigkeit des diffusiblen Signalmoleküle zu embryonalen Spinal kommissuralen Axone neu ausrichten

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

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